miR-152-3p调控人诱导多能干细胞定向分化为胰岛素分泌细胞的作用

发布时间：2020-11-18 02:55

　　 目的:本课题组前期在筛选与胰腺发育相关的miRNA时发现miR-152-3p参与胰岛β细胞分化、凋亡过程,但其潜在的作用及机制尚不明确,因此本研究主要探讨miR-152-3p在人诱导多能性干细胞(human induced pluripotent stem cells,hiPSCs)向IPCs分化过程中的作用,是否可促进hiPSCs向胰岛素分泌细胞分化的效率和成熟度,为干细胞治疗糖尿病奠定实验基础。方法:采用四步法诱导方案诱导hi PSCs向IPCs分化,倒置显微镜观察细胞分化过程中的形态变化;S-poly(T)plus Real-Time PCR检测各分化阶段miR-152-3p的表达水平;利用miR-152-3p过表达或抑制表达慢病毒载体分别感染hiPSCs,构建miR-152-3p过表达或抑制表达hiPSCs细胞系;分别诱导miR-152-3p过表达或抑制表达hiPSCs分化为IPCs,分阶段收集限定性内胚层细胞、胰腺祖细胞、胰岛素分泌细胞,Real-Time PCR检测各阶段标志性基因Sox17、Foxa2、PDX1、NKX6.1、Insulin、MAFA的表达水平;免疫荧光检测各阶段关键转录因子Sox17、Foxa2、PDX1、NKX6.1、Insulin的表达水平和定位,流式细胞术检测各阶段分化效率,葡萄糖刺激实验检测胰岛素分泌细胞对葡萄糖的应答能力。结果:miR-152-3p在hiPSCs向IPCs分化过程中表达呈持续上调,在限定性内胚层阶段、前肠管细胞阶段、胰腺祖细胞阶段、胰岛素分泌细胞阶段miR-152-3p表达分别增加约2倍、10倍、70倍、200倍;在成功构建的过表达或抑制表达的2个hiPSCs系中,miR-152-3p过表达hiPSCs细胞系中miR-152-3p表达上调约18倍,miR-152-3p抑制表达hiPSCs细胞系中mi R-152-3p下游靶基因DNMT1的表达水平上调约4倍;miR-152-3p抑制表达细胞系中Sox17、Foxa2、PDX1、NKX6.1、Insulin、MAFA基因表达水平显著上调,miR-152-3p过表达细胞系则显著下调;miR-152-3p抑制表达细胞系中Sox17~+Foxa2~+、PDX1~+NKX6.1~+双阳性细胞和insulin~+细胞比例明显高于对照组和miR-152-3p过表达组(P0.05),而miR-152-3p过表达细胞系中Sox17~+Foxa2~+、PDX1~+NKX6.1~+双阳性细胞和insulin~+细胞数量较对照组少(P0.05);对照组IPCs分化效率为20.8%,miR-152-3p抑制表达组IPCs的分化效率为28.5%,miR-152-3p过表达组IPCs分化效率为11.2%,抑制表达组分化效率明显高于对照组和过表达组(P0.05),而过表达组分化效较对照组低(P0.05);葡萄糖刺激实验结果表明,抑制miR-152-3p表达组与对照组和过表达miR-152-3p组比较,胰岛素分泌量和C-肽分泌量显著升高(P0.01),而过表达miR-152-3p组较对照组胰岛素和C-肽分泌均有所下降(P0.05)。结论:本研究构建了mi R-152-3p过表达或抑制表达的hiPSCs细胞系,诱导分化过程中证明抑制miR-152-3p可促进各分化阶段标志性基因和关键转录因子的表达,促使hiPSCs向IPCs分化,提高IPCs的分化效率和胰岛素的分泌能力;而过表达miR-152-3p可抑制hiPSCs向IPCs分化和胰岛素分泌。表明miR-152-3p在hiPSCs体外分化为IPCs的过程中发挥负调控作用。
【学位单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.1
【部分图文】：

图 1 S-Poly(T) Plus 法检测 miRNA 的原理图 细胞总 RNA 的提取孔板接种 hiPSCs，四步法诱导分化至 DE、PP、IPCs 阶段。 1mL DMEM/F12 培养基洗涤细胞 2～3 次，随后加 1mL/孔 Trizol 裂下放置 3～5min 后，用 1mL 移液器轻轻吹打孔底使细胞脱落 ，直至细解，将细胞裂解液转移至无RNA酶的 1.5mL Ep 管，继续使细胞充分裂，置于-80℃冰箱长期保存。入 200μL 三氯甲烷，用 VORTEX 剧烈震荡 30 秒，室温下静置 10mi前预冷 4℃高速离心机，离心力 12000×g，离心 15min。移离心后的水相层至新的无 RNA 酶的 1.5mL Ep 管。(注：勿吸到中间有机相)等体积的、-20℃预冷的异丙醇，上下颠倒数次使其充分混匀，-20℃冰。

图 2 hiPSCs 向 IPCs 分化过程中的形态变化(放大倍数：100×)信息学分析 miR-152-3p 的功能富集 DIANATOOLS 数据库分析 miR-152-3p 与胰岛β细胞分化、凋，如图 4 所示。

遵义医学院硕士学位论文 李兰兰图 2 hiPSCs 向 IPCs 分化过程中的形态变化(放大倍数：100×)3.2 生物信息学分析 miR-152-3p 的功能富集通过 DIANATOOLS 数据库分析 miR-152-3p 与胰岛β细胞分化、凋亡过程及功能相关，如图 4 所示。
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本文编号：2888254