雷公藤甲素、雷公藤红素通过调节中性粒细胞活性治疗类风湿关节炎的机制研究

发布时间：2020-11-18 12:02

　　 类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以炎性滑膜炎特点的慢性自身免疫性疾病。中性粒细胞在RA的发生发展中扮演着重要的角色。在RA发生的早期,中性粒细胞通过分泌大量的炎性介质,造成组织的炎性损伤。另外,中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)还与早期RA病人体内自身抗体的产生密切相关。因此,中性粒细胞是RA治疗的重要靶点。雷公藤是临床上治疗RA的有效药物,但是其作用机制尚未完全阐明。鉴于中性粒细胞在RA发病早期发挥的重要作用,本研究通过分析雷公藤主要活性成分雷公藤甲素、雷公藤红素对中性粒细胞的免疫调节作用来阐释雷公藤治疗RA的免疫机制。我们通过动物实验和体外细胞实验证明,雷公藤甲素、雷公藤红素通过抑制中性粒细胞介导的炎症反应,从而达到治疗RA的效果。该发现有助于进一步阐明雷公藤治疗RA的分子机制,揭示雷公藤起效时间明显早于其他药物的机制,从而为指导雷公藤临床应用提供理论指导。第一部分雷公藤甲素通过抑制中性粒细胞介导的炎症反应治疗RA目的:检测雷公藤甲素对RA的治疗作用和对中性粒细胞的调节作用及其关联。方法1、动物实验选8周龄的C57BL/6小鼠通过佐剂诱导关节炎(adjuvant-induced arthritis,AA)方法造模,造模成功后对治疗组AA小鼠给予雷公藤甲素70 μg/kg/d腹腔注射。治疗过程中定期测定关节直径并且进行关节炎评分。治疗周期结束后通过H-E染色对炎症关节进行病理分析。通过免疫组化法分析中性粒细胞相关的髓过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)和弹性蛋白酶(neutrophil elastase,NE)在炎症关节的表达水平。通过ELISA法检测小鼠血清中炎性因子的表达水平。2、细胞实验分离纯化正常小鼠腹腔中性粒细胞,给予脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激,同时分别加入0、10、50、200 nM的雷公藤甲素,2 h后收集中性粒细胞纯化RNA,使用Q-PCR法分析TNFα、IL-6、GM-CSF、CCL-5的基因表达水平。同时收集细胞上清,通过ELISA法检测炎性细胞因子TNFα、IL-6的蛋白表达量。通过Western blot法检测Bcl-2、Bax、caspase-3和p-ERK的蛋白质表达水平来评价雷公藤甲素对中性粒细胞凋亡的影响。通过免疫荧光法来检测雷公藤甲素对NETs的形成影响。结果:动物实验方面,雷公藤甲素显著缓解AA小鼠关节炎症状。治疗组小鼠与未治疗组小鼠相比,炎症关节肿胀程度明显减轻,关节炎评分也显著降低。H-E染色发现,治疗组炎症关节部位的炎症程度得到明显改善。免疫组化法发现治疗组小鼠的MPO和NE表达减少。ELISA法发现雷公藤甲素可以明显降低AA小鼠血清TNFα和IL-6的含量。细胞实验,我们发现雷公藤甲素能够抑制中性粒细胞表达和分泌炎性细胞因子。Q-PCR法发现雷公藤甲素能够剂量依赖性地抑制LPS刺激后中性粒细胞TNFα、IL-6、GM-CSF、CCL-5等细胞因子和趋化因子mRNA的表达。ELISA法发现雷公藤甲素能够显著抑制中性粒细胞TNFα、IL-6等炎症因子的分泌。雷公藤甲素可以增加促凋亡蛋白表达,减少抑制凋亡蛋白的表达,减少ERK蛋白的磷酸化,增加caspase-3的活化,从而促进中性粒细胞的凋亡。雷公藤甲素还能够抑制NETs的形成。结论:雷公藤甲素可以通过抑制中性粒细胞介导的炎症反应来治疗RA。第二部分雷公藤红素通过抑制中性粒细胞炎症治疗RA目的:检测雷公藤红素对RA的治疗作用和对中性粒细胞的调节作用及其关联。方法:1、动物实验选8周龄的C57BL/6小鼠使用AA法制备关节炎模型,造模成功后对治疗组AA小鼠给予雷公藤红素0.5 mg/kg/d腹腔注射。治疗过程中定期测定关节直径并且进行关节炎评分。治疗周期结束后通过H-E染色对炎症关节进行病理分析。通过免疫组化法分析检测炎症关节部位中性粒细胞相关的MPO和NE的表达量。通过ELISA法检测小鼠血清中炎性细胞因子的表达水平。2、细胞实验分离纯化正常小鼠腹腔中性粒细胞,给予LPS刺激,同时分别加入0、1、5、10 μM的雷公藤红素,2h后收集中性粒细胞纯化RNA,使用Q-PCR法分析TNFα、IL-6的基因表达。同时收集细胞培养上清,通过ELISA法检测炎性细胞因子TNFα、IL-6的蛋白表达量。通过Western blot法检测Bcl-2、Bax、caspase-3等的蛋白质表达水平来评价雷公藤红素对中性粒细胞凋亡的影响。通过免疫荧光法来检测雷公藤红素对NETs的形成影响。结果:动物实验方面,雷公藤红素能够显著减轻AA小鼠关节肿胀,关节炎评分也显著降低。H-E染色发现,治疗组炎症关节部位的炎症程度得到明显改善。免疫组化法发现治疗组小鼠的MPO和NE表达减少。ELISA法发现雷公藤红素可以明显降低AA小鼠血清TNFα和IL-6的含量。细胞实验方面,雷公藤红素抑制LPS刺激后中性粒细胞表达和分泌炎性细胞因子。Q-PCR法发现雷公藤红素能够剂量依赖性地抑制LPS刺激后中性粒细胞TNFα、IL-6的表达。ELISA法发现雷公藤红素能够显著抑制中性粒细胞TNFα、IL-6的分泌。雷公藤红素可以增加促凋亡蛋白的表达,减少抑制凋亡蛋白的表达,增加caspase-3的活化,从而促进中性粒细胞的凋亡。雷公藤红素还能够抑制NETs的形成。结论:雷公藤红素通过抑制中性粒细胞介导的炎症反应来治疗RA。
【学位单位】：北京中医药大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R593.22
【部分图文】：

我们在实验中使用ＡＡ小鼠作为研究ＲＡ的动物模型，研究雷公藤甲素对ＡＡ小??鼠抗炎方面的作用。造模成功后，我们给予毎只治疗组小鼠雷公藤甲素７０ｕｇ／ｋｇ／ｄ腹腔??注射。如图１－１所示，与未治疗组相比，雷公藤甲素治疗组的小鼠关节肿胀程度明显缓??解。另外治疗后ＡＡ小鼠的关节炎评分也明显降低。未治疗组的ＡＡ小鼠关节处都有比??较严重的红肿。而治疗组的ＡＡ小鼠关节炎部位只有轻度红肿。我们还对炎症部位做了??病理分析，小鼠关节病理Ｈ－Ｅ染色发现，雷公藤甲素治巧组炎症部位病理切片的炎症??程度明显较未治疗组有得到改善，炎性细胞浸润明显减少。同时甲素治疗组还有软骨和??骨质破坏的明显减轻等表现。说明雷公藤甲素对ＡＡ小鼠有很好的关节保护作用。??５６??

图１－２免疫组化法分析关节处ＭＰＯ和ＮＥ的表达??免疫组化法分析小鼠关节ＭＰＯ和ＮＥ的表达

?裝議達曝囊Ｓ義蕃筆舊??酵把？’規端義議繁纖難绩??图１－２免疫组化法分析关节处ＭＰＯ和ＮＥ的表达??免疫组化法分析小鼠关节ＭＰＯ和ＮＥ的表达。Ｃｏｎｔｒｏｌ组表示未造模的完全正常小鼠关节ＭＰＯ??和ＮＥ的表达；ＲＡ组表示未治疗组ＡＡ小鼠炎症关节部位ＭＰＯ和ＮＥ的表达；Ｔｒｉｐｔｏｌｉｄｅ表示雷公??藤甲素治疗组小鼠炎症关节部位ＭＰＯ和ＮＥ的表泣。结果显示，Ｃｏｎｔｒｏｌ组中，正常小鼠关节表达??ＭＰＯ和Ｎ巨极少。与Ｃｏｎｔｒｏｌ组小鼠关节相比，ＲＡ组小鼠关节部位ＭＰＯ和ＮＥ的表达明显增多，??呈环状包绕分布，图中箭头所指处的栋色即为ＲＡ组中鳥表达的ＭＰＯ和ＮＥ。由于中性粒细胞多分??布于ＲＡ新生血管周围，故ＭＰＯ和ＮＥ的表达也多为环状包绕分布。雷公藤甲素治疗组与未治疗组??相比，免疫组化法发现ＭＰＯ和ＮＥ的表达明显减少。说明雷公藤甲素能够抑制ＡＡ小鼠关节炎部位??ＭＰＯ和ＮＥ的表达。??５８??
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本文编号：2888696