人羊膜间充质干细胞条件性培养基对高脂饮食诱导小鼠肥胖的影响及其作用机制

发布时间：2020-11-19 02:51

　　 背景与目的肥胖是由多种因素引起的慢性代谢性疾病,常可导致糖尿病,心脏病,血脂异常及高血压等一系列并发症。人羊膜间充质干细胞(Human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)是一种来源于人羊膜,具有低免疫原性,高多向分化潜能、没有致瘤作用的多功能干细胞。研究表明,间充质干细胞及其分泌的细胞因子在抑制炎症、组织修复及免疫调节等方面具有重要的应用价值,但hAMSCs,特别是hAMSCs条件性培养基(Human amniotic mesenchymal stem cells conditional medium,hAMSCs-CM)对肥胖及其代谢病理进程中的影响尚无明确报道。本课题旨在利用高脂饮食(High fat diet,HFD)诱导的小鼠肥胖模型,探讨hAMSCs-CM对小鼠肥胖的影响,同时在体外细胞水平探讨hAMSCs-CM对前体脂肪细胞3T3L1成熟分化以及巨噬细胞炎性分泌中的作用,最后结合蛋白芯片结果明确可能发挥作用的活性因子。本课题的完成将为深入挖掘hAMSCs-CM在肥胖防治中的应用潜能提供新的思路。实验方法1.hAMSCs及其hAMSCs-CM的制备:取健康无致病菌产妇当日羊膜,分别以胰酶及胶原酶消化得原代hAMSCs细胞,细胞培养5代以内换无血清DMEM处理48小时浓缩备用,最后按照1.5×10~6细胞密度收集CM每20g小鼠进行给药。2.HFD诱导小鼠肥胖模型的建立:高脂饮食喂养小鼠15周建立肥胖模型,同时每周腹腔注射hAMSCs-CM一次,并通过检测小鼠体重、组织形态染色、血脂及葡萄糖耐受等表型分析明确hAMSCs-CM对肥胖的影响。3.机制分析:1)利用油红染色观察hAMSCs-CM对前脂肪细胞3T3L1分化为成熟脂肪细胞的影响,并利用QPCR及Western blot法检测脂质合成相关基因蛋白PPARγ,SREBP1,FASN的表达;2)利用QPCR法检测hAMSCs-CM对巨噬细胞极化的影响,以LPS+IFN-γ处理RAW264.7巨噬细胞检测M1型促进炎症相关蛋白基因的表达,另以IL-4处理RAW264.7巨噬细胞检测M2型抑制炎症相关基因蛋白的表达。实验结果1.hAMSCs-CM明显改善HFD诱导的小鼠肥胖、脂肪肝,并可以降低HFD引起的高血脂、脂肪细胞肥大及葡萄糖耐受。2.hAMSCs-CM抑制前脂肪细胞向脂肪细胞的成熟分化:1)油红染色结果显示hAMSCs-CM可降低诱导分化引起的脂质累积;2)QPCR及Western blot检测显示,hAMSCs-CM可显著抑制脂质合成相关基因蛋白PPARγ,SREBP1,FASN的转录与表达。3.hAMSCs-CM显著抑制LPS+IFN-γ诱导的RAW264.7巨噬细胞M1型炎症因子IL-6,IL-1β的转录以及促进IL-4诱导的M2型抗炎因子ARG-1,IL-10的转录。结论hAMSCs-CM对HFD诱导的小鼠肥胖有显著的抑制作用,其机制可能是通过抑制脂肪细胞的成熟分化、进而影响其脂质累积及促进巨噬细胞M1型向M2型的转化而发挥作用。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R589.2
【部分图文】：

14图 2.1 高脂饮食（HFD）对小鼠各脂肪组织的影响。（A）高脂饮食 15 周后小鼠体重变化(g)；（B）15 周高脂后各组小鼠肝脏；HE 染色观察各组小鼠肝脏形态（10×）；(C)肝脏组织甘油三酯（TG）含量检测；（D-F）各组小鼠肝脏，腹部白色脂肪，肾脏周围白色脂肪重量（g）；（G）各组小鼠腹部白色脂肪 HE 染色（10×）； （H）G 图统计（n=3，*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001vs HFD, #p<0.05,##p<0.01,###p<0.001vs CHOW-D）。

第 2 章 人羊膜来源的间充质干细胞条件性培养基对饮食诱导的肥胖的影响2.4.2 hAMSCs-CM 显著改善对肥胖早期引起的葡萄糖耐受肥胖是由中枢神经－内分泌系统调节网络失调引起的代谢综合症，而葡萄糖耐受是其病理进程的一个关键环节。为了研究 hAMSCs-CM 对葡萄糖耐量的影响，我们在喂养的第 10 周及第 15 周进行了相关检测。禁食 16 小时后腹腔注射葡萄糖，结果显示，第10周时HFD组葡萄糖注射后其血糖浓度显著高于ND组，hAMSCs-CM 给药可有效改善血糖的升高，这一现象说明 hAMSCs-CM 能够显著改善 HFD 引起的葡萄糖耐受（图 2.2 A）。但是到第 15 周 hAMSCs-CM 所表现出的改善作用完全消失，我们认为其可能与模型后期小鼠体重快速累积，体重逐步超重有关（图 2.2 B）。以上实验结果说明 hAMSCs-CM 能够在肥胖的早期显著改善其葡萄糖耐受。

第 2 章 人羊膜来源的间充质干细胞条件性培养基对饮食诱导的肥胖的影响鼠的甘油三酯（TG），总胆固醇（TC），低密度脂蛋白（LDL）及高密度脂蛋白（HDL）均出现了明显升高（图 2.3 D.E.F.G），hAMSCs-CM 处理对其均有一个明显改善作用。严重的肥胖也多伴有肾功能损伤。经检测 15 周的 HFD 喂养并未引起血肌酐（CREA）和尿素氮（BUN）的分泌异常，hAMSCs-CM 的处理也未发现对肾功能的影响（图 2.3 H.I）。
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本文编号：2889586