二甲双胍与HMS5552联用对2型糖尿病大鼠糖代谢作用机制的研究

发布时间：2020-11-20 15:37

　　 目的:研究二甲双胍与葡萄糖激酶激活剂(glucokinase activators,GKAs)HMS5552联用对2型糖尿病(type 2 Diabetes Mellitus,TD2M)大鼠糖代谢的作用机制。方法:从100只健康雄性SD大鼠中随机挑出8只作为正常对照组(normal control group,NC),喂以普通饲料,其余用高脂高糖饲料喂养2个月后采用一次性腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)40mg/kg的方法诱导建立2型糖尿病大鼠模型,连续两次空腹血糖(fasting plasma glucose,FPG)≥8.0mmol/L的即为2型糖尿病大鼠模型。建模成功后,禁食12小时,麻醉大鼠,心脏取血,离心取上清,测FPG、甘油三酯(triglyceride,TG)、总胆固醇(total cholesterol,TC)、胰岛素(insulin,INS)和胰高血糖素(glucagon,GC)含量。将建模成功的大鼠随机分为七组,每组8只1.糖尿病组(diabetes group,DM)2.HMS5552低剂量治疗组(HMS-L,10 mg/kg HMS5552)3.HMS5552高剂量治疗组(HMS-H,30 mg/kg HMS5552)4.二甲双胍低剂量治疗组(MET-L,80 mg/kg二甲双胍)5.二甲双胍高剂量治疗组(MET-H,240 mg/kg二甲双胍)6.HMS5552低剂量+二甲双胍低剂量治疗组(HMS-L+MET-L,10 mg/kg HMS5552+80 mg/kg二甲双胍)7.HMS5552低剂量+二甲双胍高剂量治疗组(HMS-L+MET-H,10 mg/kg HMS5552+240 mg/kg二甲双胍)。分组后,尾静脉采血做口服葡萄糖耐量试验(oral glucose tolerance test,OGTT)和口服药物耐量试验(oral drug tolerance test,ODTT)。每天对各组进行相应药物灌胃,NC组和DM组用等体积生理盐水灌胃。药物治疗期间,观察大鼠的一般情况,每周测体重。药物治疗4周,禁食12小时后,尾静脉采血做OGTT、ODTT实验,处死大鼠,心脏取血,离心取上清,测FPG、TG、TC、INS和GC含量。采用6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联比色法检测肝脏组织中葡萄糖激酶(glucokinase,GK)的酶活性;采用RT-PCR法检测GK的表达变化;取肝脏、胰腺组织HE染色观察病理学变化,免疫组织化学染色观察肝脏中GK、胰腺中INS和GC的表达;采用western-blot法检测肝脏组织GK、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、磷酸化乙酰辅酶A羧化酶(P-ACC)在蛋白水平的表达情况。结果:(1)成功建立2型糖尿病大鼠模型,FPG8.0mmol/L。(2)体重方面,未注射STZ前,高脂高糖饲料喂养的大鼠体重增长速度高于正常组。第14周,与DM组比较,HMS-H组,MET-H组差异有统计学意义(P0.05),HMS-L+MET-L组,HMS-L+MET-H组差异显著(P0.01)。(3)OGTT结果显示,治疗后,与DM组相比,所有治疗组的△AUC0-240均有所下降(P0.01)。且HMS-H组,MET-H组,HMS-L+MET-L组和HMS-L+MET-H组的葡萄糖达峰时间较用药前提前30min。(4)ODTT结果显示,治疗后,各治疗组的初始血糖较治疗前有了不同程度的下降,餐后60min最大血糖值较治疗前下降明显;与DM组相比,HMS-H组、HMS-L+MET-H组差异有统计学意义(P0.05)。(5)血清学指标显示,治疗后,高脂高糖喂养的大鼠胆固醇(TC)水平较治疗前有所升高,但各治疗组的TC水平低于同时期的DM组。治疗后,各组大鼠的甘油三酯(TG)水平较治疗前有所升高,但各治疗组的TG水平低于同时期的DM组。治疗前,高脂高糖喂养的大鼠空腹血糖(FPG)明显高于NC组,显示造模成功。治疗后,与DM组相比,HMS-L组差异有统计学意义(P0.05),其余治疗组的下降幅度较大(P0.01)。治疗后,与DM组相比,MET-H组血清胰岛素(INS)水平升高明显(P0.01)。治疗后,各组大鼠的血清胰高血糖素(GC)水平较治疗前有所下降。与DM组相比,各治疗组差异无统计学意义(P0.05)。(6)GK酶活性结果显示,治疗后,与DM组相比,MET-L组、MET-H组差异有统计学意义(P0.05),其余各治疗组差异明显(P0.01)。(7)GKm RNA结果显示,治疗后,与DM组比,各治疗组的表达量显著增加(P0.01)。(8)肝脏HE染色结果显示,NC组大鼠肝脏中肝细胞结构完整,肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列,肝小叶及细胞核结构正常。DM组大鼠肝细胞出现了脂肪样变,肝细胞核发生了核溶解,肝索排列紊乱。各治疗组都有了不同程度的改善。胰腺HE染色结果显示,NC组大鼠胰腺组织结构形态完整,胰岛细胞清晰可见,胰岛内部的细胞呈团索状整齐排列。DM组大鼠胰岛内细胞有所减少并出现萎缩。各治疗组胰岛内细胞较DM组有所增加,萎缩程度也有所减轻。(9)免疫组化染色结果显示,与DM组相比,HMS-L组的GK表达量有所升高(P0.05),HMS-H组、HMS-L+MET-L组和HMS-L+MET-H组明显升高(P0.01)。胰岛素(INS)染色结果显示,与DM组相比,HMS-H组、MET-L组的INS表达量有所升高(P0.05),MET-H组、HMS-L+MET-L组和HMS-L+MET-H组升高明显(P0.01)。胰高血糖素(GC)染色结果显示,与DM组相比,MET-L组的GC表达量有所下降(P0.05),其余各治疗组明显下降(P0.01)。(10)免疫印迹结果显示,GK的蛋白表达,除MET-L和MET-H组外其余各治疗组与DM组相比,GK的表达量都升高明显(P0.01)。AMPK免疫印迹结果显示,与DM组相比,各治疗组AMPK的表达量显著升高(P0.01)。P-ACC/ACC免疫印迹结果显示,与DM组相比,HMS-L组表达量的差异无统计学意义(P0.05),HMS-H组表达量有差异性(P0.05),其余四组差异显著(P0.01)。结论:(1)降低血糖方面,联合用药优于单独用药。(2)提升胰岛素及降低胰高血糖素方面,联合用药优于单独用药。(3)HMS5552可以升高GK的浓度及活性,二甲双胍可以升高GK的浓度,联合用药优于单独用药。(4)HMS5552可能通过AMPK-ACC信号通路降低血糖。
【学位单位】：河南科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.1
【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 绪论
    1.1 糖尿病概述
    1.2 糖尿病的流行病学及发病机制
        1.2.1 糖尿病的流行病学及危害
        1.2.2 2型糖尿病的发病机制
    1.3 2型糖尿病的治疗
        1.3.1 运动调节
        1.3.2 西药治疗
        1.3.3 中药治疗
        1.3.4 减重手术治疗
    1.4 葡萄糖激酶
    1.5 葡萄糖激酶激活剂
        1.5.1 葡萄糖激酶激活剂治疗2型糖尿病
    1.6 二甲双胍
        1.6.1 二甲双胍的降糖机制
        1.6.2 二甲双胍联合西药的降糖疗效
        1.6.3 二甲双胍联合中药的降糖疗效
第2章 前言
第3章 材料与方法
    3.1 实验材料
        3.1.1 实验动物
        3.1.2 实验仪器
        3.1.3 实验试剂
        3.1.4 试剂配方
    3.2 实验方法
        3.2.1 2型糖尿病大鼠模型的建立、分组及药物治疗
        3.2.2 口服葡萄糖耐量实验
        3.2.3 口服药物耐量实验
        3.2.4 标本采集及血液生化指标的测定
        3.2.5 肝脏组织中GK的酶活性测定
        3.2.6 RT-PCR法检测大鼠肝脏组织中GKm RNA的表达
        3.2.7 大鼠肝脏、胰腺组织的石蜡块制备
        3.2.8 HE染色及免疫组织化学染色
        3.2.9 免疫印迹法检测肝组织GK、AMPK、ACC、P-ACC蛋白的表达情况
    3.3 实验数据的统计学分析
第4章 结果
    4.1 实验大鼠的一般情况
    4.2 实验大鼠的体重变化
    4.3 联合用药对大鼠OGTT结果的影响
    4.4 联合用药对大鼠ODTT结果的影响
    4.5 联合用药对大鼠血清学指标的影响
    4.6 联合用药对大鼠肝脏GK酶活性的影响
    4.7 联合用药对大鼠肝脏GK m RNA表达的影响
    4.8 HE染色观察联合用药对大鼠肝脏、胰腺组织结构影响
        4.8.1 联合用药对大鼠肝脏组织结构影响
        4.8.2 联合用药对大鼠胰腺组织结构影响
    4.9 免疫组织化学染色观察联合用药对大鼠肝脏、胰腺中相关因子表达的影响
        4.9.1 联合用药对大鼠肝脏组织中GK的表达情况影响
        4.9.2 联合用药对大鼠胰腺组织中INS、GC的表达情况影响
    4.10 联合用药对大鼠肝脏组织中GK、AMPK、ACC、P-ACC蛋白表达水平的影响
第5章 讨论
    5.1 2型糖尿病大鼠模型
    5.2 联合用药对大鼠糖代谢的影响
    5.3 联合用药对GK及其活性的影响
    5.4 联合用药对胰岛素的影响
    5.5 联合用药对胰高血糖素的影响
    5.6 联合用药对AMPK/ACC信号通路的影响
    5.7 问题与展望
第6章 结论
参考文献
缩略词汇表
附录
致谢
攻读学位期间的研究成果

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本文编号：2891629