高血糖诱导的血管内皮细胞损伤的分子机制研究

发布时间：2020-11-20 17:50

　　 背景:糖尿病是心血管疾病加速发展的重要独立危险因素,也是当前医学界亟需解决的科学难题。最新研究表明,长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)在糖尿病血管并发症的形成中发挥了至关重要的调控作用。然而,尚不明确lncRNA在高血糖诱导的内皮细胞损伤中的作用机制。方法:在本课题组的前期研究中,通过测序发现了多个在高糖刺激下表达上调的新lncRNA,我们选取有明显差异性表达的lnc58(后称HAVEN)深入分析其作用机制。通过构建体外高糖刺激细胞模型,研究HAVEN及其邻近基因的表达变化。构建 1-磷酸鞘氨醇受体 1(Sphingosine-1-phosphate receptor 1,S1PR1)、Kruppel样转录因子2(Kruppel-like Factor 2,KLF2)质粒,利用实时荧光定量PCR、Western Blot 检测血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric-oxide synthase,eNOS)等基因的表达。利用小干扰RNA分别敲低人动脉内皮细胞中KLF2和S1PR1的表达,评价三者之间是否存在直接或间接作用。结果:前期实验结果表明HAVEN是高血糖诱导表达的新lncRNA。其邻居基因S1PR1及其转录因子可参与HAVEN的表达调控,并通过调控内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、血管细胞粘附分子-1(vascular cell adhesion molecule 1,VCAM-1)的表达,参与血管内皮细胞的炎症反应。为研究其具体分子机制,我们构建了体外细胞模型,发现高糖刺激人主动脉内皮细胞(Human Aortic Endothelial Cells,HAEC)24小时后,HAVEN的表达有明显上调,而S1PR1、KLF2转录下调。构建S1PR1、KLF2质粒,发现在高血糖诱导的细胞损伤模型中,分别过表达S1PR1或KLF2,均可逆转高糖引起的HAEC中VCAM-1和eNOS的表达改变,并且过表达KLF2可上调S1PR1。利用小干扰RNA可分别敲低HAEC中KLF2和S1PR1的表达,并且敲低KLF2不仅能下调S1PR1的表达,还能下调HAVEN。但针对HAVEN三个位点设计的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)不能有效敲低HAVEN。结论:本研究以此前期测序结果为基础,发现一种新的lncRNA(HAVEN),HAVEN可通过与临近基因S1PR1及其转录因子KLF2相互作用介导动脉内皮细胞的炎症反应,为糖尿病血管并发症提供了新的分子通路和干预靶标。目的:采用数据挖掘方法,基于Matlab平台对基因网络扰动可视化,以直观显示短时高血糖状态下动脉血管转录组改变。方法:在美国国立卫生研究中心(NCB1)GEO数据库下载数据集。利用Matlab将数据转化为计算机可识别的结构体,经过数据筛选,获得短时高血糖后表达模式扰动最明显的基因谱。利用三种聚类算法分析,基于DAVID进行基因本体学(gene ontology,GO)注释及富集分析,把相关通路标定在KEGG通路中,形成基因——表达谱系统分析。结果:经过对数据集的筛选、聚类将基因的变化模式归为9类,在该模型中有效地反应出短时高血糖对动脉血管的急性早期效应。GO富集分析显示,在急性炎症反应、心肌重构、维持细胞内钙离子稳态、细胞周期调控、细胞趋化作用等方面的基因显著富集;其中以与粘多糖、糖蛋白结构相关基因、脂肪分解代谢、肌原纤维组装相关基因显著富集。这些发现与以往研究的结论相吻合。K-均值聚类方法显示,在高血糖环境下基因表达上调,且不随血糖恢复正常表达的基因,主要有参与细胞周期调控、心肌重构、维持细胞内钙离子稳态的基因。结论:利用数据挖掘方法,实现急性高血糖对小鼠动脉基因表达谱波动模式的可视化描述,并为糖尿病的“代谢记忆”机制提供新的解释,即早期的高糖效应带来的动脉血管的不可逆的损伤,是导致冠心病患者降糖治疗无效的原因。即短暂的高糖水平的暴露可在分子水平上起到长久的影响。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R587.2
【部分图文】：

无相关报道。因此，我们将?ｌｎｃＲＮＡ５８?命名为?Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ?Ｖａｓｃｕｌａｒ??Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ?ｃｅｌｌ?ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ?Ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ?ＲＮＡ?（ＨＡＶＥＮ），并以?ＨＡＶＥＮ?及其邻居基因??Ｓ１ＰＲ１为研宄的主要对象（图１）。??ｈ?—?Ｈ??Ｓ１ＰＲ１?ＨＡＶＥＮ??Ｃｈｒｌ?—?????２４ｋｂ?＾??３０??１?ｉ?ＮＧ?，?．?ｔ?Ｉ??｜?ｅｘ：?〇????．?．?ｉ??ｉ?３０??ＨＧ??｜?．．?．???Ｉ??Ｉ?２６?Ｉ??１?＾?ＮＧ?１??？?Ｅ?｜?Ｉ??１?ｓ?？?．一?ｉ．?■??Ｉ?２?ＨＧ?｜?！??Ｉ．?１?Ｉ??图１ＵＣＳＣ显示ＨＡＶＥＮ和其上游基因Ｓ１ＰＲ１的相对位置及Ｈ３Ｋ４ｍｅ３分布??５．２高糖诱导ＨＡＶＥＮ及其临近基因表达??为验证ＲＮＡ－ｓｅｑ所发现的ＨＡＶＥＮ是否真实存在，我们首先根据ＲＮＡ－ｓｅｑ预??测的ＨＡＶＥＮ的第一个外显子区域设计引物。构建体外细胞模型，分别用普通浓度??（ｎｏｒｍａｌ?ｇｌｕｃｏｓｅ，ＮＧ，?５．６ｍＭ）和高糖（ｈｉｇｈ?ｇｌｕｃｏｓｅ，ＨＧ，２５ｍＭ）刺激人动脉??１７??

内皮细胞２４小时。随后，我们用ｑＲＴ－ＰＣＲ分别检测ＨＡＶＥＮ、Ｓ１ＰＲ１、ＫＬＦ２在??ＲＮＡ水平上的变化。结果显示，ＨＡＶＥＮ在高糖刺激后表达明显上调，而Ｓ１ＰＲ１??转录下调（图２：?＊＊＊ｐ＜０．００１），与测序结果相一致。ＫＬＦ２是Ｓ１ＰＲ１的重要转录因??子，ｑＲＴ－ＰＣＲ结果显示ＫＬＦ２的表达也明显下调（图２：?＊＊＊ｐ＜０．００１）。因而我们??设想ＨＡＶＥＮ转录表达可能受Ｓ１ＰＲ１的直接或间接调控。??｜１Ｓ１?■?ＮＧ?｜＇＊?ｆｌＮＧ?Ｊ９，?＿＿?■?ＮＣ??■?ＨＧ?？?■?ＨＧ?＜４－?■?ＨＧ??ｒ?■?ｒ?＿??ｄ?＿?ｉ］?ｍ?＾?ｊ?ｍ?Ｌｌｉ??Ｓ１ＰＲ１?ＫＬＦ２?ＨＡＶＥＮ??图２高糖（ＨＧ）刺激下Ｓ１ＰＲ１、ＫＬＦ２、ＨＡＶＥＮ的表达水平??５．３?ＨＡＶＥＮ?具有?ｐｏｌｙＡ?尾??研究表明，约６０％成熟的非编码ＲＮＡ?（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ，ｎｃＲＮＡ）有多聚腺??苷酸（ｐｏｌｙＡ）尾，以此维持ＲＮＡ结构稳定。为了确定ＨＡＶＥＮ是否有ｐｏｌｙ尾修??饰，分别以和随机六聚体（ｒａｎｄｏｍ?ｈｅｘａｍｅｒ）为逆转录（ｒｅｖｅｒｓ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ，?ＲＴ）??引物，其中ｏｌｉｇｏ?ｄＴ只能与带有ｐｏｌｙ?Ａ尾修饰的ＲＮＡ结合，ｒａｎｄｏｍｈｅｘａｍｅｒ可与??所有ＲＮＡ结合。因此，用ｏｌｉｇｏ?ｄＴ引物得到的ｃＤＮＡ库，将只包含具有ｐｏｌｙ?Ａ尾??修饰的ＲＮＡ。既往研宄已证实

图３?ＨＡＶＥＮ的ｐｏｌｙ?Ａ尾修饰??
【参考文献】

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本文编号：2891780