高糖作用下大鼠海马神经元MLCK表达与MAPK/ERK通路的相关性及二苯乙烯苷对神经元保护作用机制的探讨
发布时间：2020-12-06 03:08
目的:建立SD大鼠海马神经元细胞原代培养模型,确定最适的高糖作用浓度和作用时间;检测高糖作用下海马神经元细胞内ERK、p-ERK和MLCK的表达;探讨高糖环境下海马神经元细胞MLCK与MAPK/ERK信号通路的相关性;初步研究高糖作用后二苯乙烯苷致MLCK表达下降的作用机制。方法:1.海马神经元细胞的原代培养及鉴定:以25mM为基础糖浓度培养海马神经元细胞,并用倒置显微镜观察海马神经元的形态;细胞培养至第7天,通过NSE免疫组化染色鉴定海马神经元细胞的纯度,并计算海马神经元细胞的纯度;2.最适高糖浓度探索:原代培养海马神经元细胞,将细胞悬液接种到96孔板中,细胞培养至第5天,将细胞分为25mM-24h组、25mM-48h组、25mM-72h组、45hmM-24h组、45mM-48h组、45mM-72h组;达到各组相应的糖作用时间后,用CCK-8试剂盒检测各组细胞的OD值,计算各组海马神经元的活性,得出最适高糖作用浓度。3.最适高糖作用时间的探索:原代培养海马神经元细胞,将细胞悬液接种到玻底培养皿中,将细胞分为25mM组、45hmM-24h组、45mM-48h组、45mM-72h组;达到...
【文章来源】：贵州医科大学贵州省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
剪开颅骨后的整个大脑
图 1 剪开颅骨后的整个大脑 图 2 暴露的海马组织Fig.1 and 2 Sampling of hippocampal neurons1.2.3 海马神经元细胞的鉴定（NSE 染色法）（1）准备工作：细胞爬片的预处理：将细胞置于 24 孔板中，用 PBS 4 倍稀释 10×PLL，取适量铺满培养板底部，置于细胞培养箱过夜后，PBS 漂洗 3 次，并放入培养箱晾干备用（所有操作均在超净工作台中）。（2）细胞培养方法同 2.2，直至制成细胞悬液。（3）免疫组化染色①将细胞悬液以5×105/mL 的密度接种到放置了细胞爬片的 24 孔培养板中；②细胞培养至第 7 天，从 24 孔板中取出爬片，37℃的 0.01M 的 PBS 浸洗 3次×2min；
个别细胞已开始长出突起，形态为圆形、椭圆形、锥体状及不规则形；细胞胞体透亮、饱满，立体感强，细胞周围光晕明显，折光性强；24h 后多数细胞长出长短不一的突起，可看到相邻突起有少量连接（见图 3-1）。（2）培养 3d 后，海马神经元细胞进一步生长，胞体增大，多为圆形、椭圆形或锥体形，以双极和多极神经元为主，表面光滑，折光性强，突起较之前明显增长，局部有较多的突起相互连接成稀疏网络（见图 3-2）。（3）培养 5-7d 后，神经元细胞形态成熟饱满，体积较大，聚集生长更明显，胞浆丰富，光晕明显，发达的突起向外延伸并且变粗分出许多分支，互相连接形成密集交错的网络（见图 3-3、图 3-4）。（4）培养 11-13d 后，神经细胞更加成熟，突起变得更加粗大，网络更加致密。培养液内出现悬浮的细胞碎片，一些神经元细胞开始退化，细胞变形，突起开始断裂变短，部分细胞裂解，细胞背景不干净（见图 3-5、图 3-6）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]ERK信号转导通路与糖尿病性认知功能障碍的研究进展[J]. 邓成坤,张卫权,张霓,黄永杰,叶频. 中国现代医药杂志. 2015(12)
[2]MAPK-ERK信号转导通路在糖尿病肾病中的研究进展[J]. 刘沙,王建平. 世界最新医学信息文摘. 2015(62)
[3]何首乌有效成分二苯乙烯甙对神经细胞保护作用机制研究[J]. 徐泽鹤,易佳佳. 亚太传统医药. 2013(07)
[4]何首乌的药理作用、临床应用及不良反应[J]. 辛淑杰. 北方药学. 2013(07)
[5]高糖培养对乳鼠海马神经元存活及c-fos蛋白表达影响[J]. 凌俊辉,钟珠,蔡斯俏,张鹏,林立国. 广东医学院学报. 2013(03)
[6]二苯乙烯苷通过调节组蛋白去乙酰化酶1水平拮抗沙鼠脑缺血/再灌注损伤[J]. 陈晓宇,王栋,刘晓利,陈晓蓉,李俊. 解剖学报. 2013 (01)
[7]知母皂苷元对高糖引起的体外培养大鼠海马神经元损伤的保护作用[J]. 肖复茜,李洪秀,隋海娟,刘卓,屈文慧,郁盛雪,金迎新,金英. 中国药理学通报. 2013(01)
[8]不同糖浓度中大鼠DRG神经元相关蛋白表达及Ca2+浓度的测定[J]. 丁炎,那存乌力吉,阎雪晶,姚维凡,赵海山,陈磊. 中国医科大学学报. 2012(12)
[9]二苯乙烯苷对SAMP8小鼠学习记忆能力的改善作用[J]. 刘玲,赖术,黎昀,黄忠仕. 中国现代中药. 2012(10)
[10]糖尿病大鼠脑内微血管细胞外信号调节激酶磷酸化的研究[J]. 黄艳,吴兴临,张建中,王岩. 宁夏医科大学学报. 2012(09)
硕士论文
[1]褪黑素通过ERK/MAPK通路调控动脉粥样硬化模型兔动脉内皮细胞MLCK的表达[D]. 程筱雯.安徽医科大学 2007
本文编号：2900602
【文章来源】：贵州医科大学贵州省
【文章页数】：59 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
剪开颅骨后的整个大脑
图 1 剪开颅骨后的整个大脑 图 2 暴露的海马组织Fig.1 and 2 Sampling of hippocampal neurons1.2.3 海马神经元细胞的鉴定（NSE 染色法）（1）准备工作：细胞爬片的预处理：将细胞置于 24 孔板中，用 PBS 4 倍稀释 10×PLL，取适量铺满培养板底部，置于细胞培养箱过夜后，PBS 漂洗 3 次，并放入培养箱晾干备用（所有操作均在超净工作台中）。（2）细胞培养方法同 2.2，直至制成细胞悬液。（3）免疫组化染色①将细胞悬液以5×105/mL 的密度接种到放置了细胞爬片的 24 孔培养板中；②细胞培养至第 7 天，从 24 孔板中取出爬片，37℃的 0.01M 的 PBS 浸洗 3次×2min；
个别细胞已开始长出突起，形态为圆形、椭圆形、锥体状及不规则形；细胞胞体透亮、饱满，立体感强，细胞周围光晕明显，折光性强；24h 后多数细胞长出长短不一的突起，可看到相邻突起有少量连接（见图 3-1）。（2）培养 3d 后，海马神经元细胞进一步生长，胞体增大，多为圆形、椭圆形或锥体形，以双极和多极神经元为主，表面光滑，折光性强，突起较之前明显增长，局部有较多的突起相互连接成稀疏网络（见图 3-2）。（3）培养 5-7d 后，神经元细胞形态成熟饱满，体积较大，聚集生长更明显，胞浆丰富，光晕明显，发达的突起向外延伸并且变粗分出许多分支，互相连接形成密集交错的网络（见图 3-3、图 3-4）。（4）培养 11-13d 后，神经细胞更加成熟，突起变得更加粗大，网络更加致密。培养液内出现悬浮的细胞碎片，一些神经元细胞开始退化，细胞变形，突起开始断裂变短，部分细胞裂解，细胞背景不干净（见图 3-5、图 3-6）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]ERK信号转导通路与糖尿病性认知功能障碍的研究进展[J]. 邓成坤,张卫权,张霓,黄永杰,叶频. 中国现代医药杂志. 2015(12)
[2]MAPK-ERK信号转导通路在糖尿病肾病中的研究进展[J]. 刘沙,王建平. 世界最新医学信息文摘. 2015(62)
[3]何首乌有效成分二苯乙烯甙对神经细胞保护作用机制研究[J]. 徐泽鹤,易佳佳. 亚太传统医药. 2013(07)
[4]何首乌的药理作用、临床应用及不良反应[J]. 辛淑杰. 北方药学. 2013(07)
[5]高糖培养对乳鼠海马神经元存活及c-fos蛋白表达影响[J]. 凌俊辉,钟珠,蔡斯俏,张鹏,林立国. 广东医学院学报. 2013(03)
[6]二苯乙烯苷通过调节组蛋白去乙酰化酶1水平拮抗沙鼠脑缺血/再灌注损伤[J]. 陈晓宇,王栋,刘晓利,陈晓蓉,李俊. 解剖学报. 2013 (01)
[7]知母皂苷元对高糖引起的体外培养大鼠海马神经元损伤的保护作用[J]. 肖复茜,李洪秀,隋海娟,刘卓,屈文慧,郁盛雪,金迎新,金英. 中国药理学通报. 2013(01)
[8]不同糖浓度中大鼠DRG神经元相关蛋白表达及Ca2+浓度的测定[J]. 丁炎,那存乌力吉,阎雪晶,姚维凡,赵海山,陈磊. 中国医科大学学报. 2012(12)
[9]二苯乙烯苷对SAMP8小鼠学习记忆能力的改善作用[J]. 刘玲,赖术,黎昀,黄忠仕. 中国现代中药. 2012(10)
[10]糖尿病大鼠脑内微血管细胞外信号调节激酶磷酸化的研究[J]. 黄艳,吴兴临,张建中,王岩. 宁夏医科大学学报. 2012(09)
硕士论文
[1]褪黑素通过ERK/MAPK通路调控动脉粥样硬化模型兔动脉内皮细胞MLCK的表达[D]. 程筱雯.安徽医科大学 2007
本文编号：2900602
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