氟对ATDC5细胞增殖和分化的影响及生物钟信号通路在其中的调控作用

发布时间：2021-11-06 07:30

　　目的:氟是人体生长发育所必需的微量元素,适量的氟可以增强牙齿的抗龋能力,但机体长期摄入过量氟会引起地方性氟中毒。由于骨组织是氟主要的靶器官,因此过量氟引起的氟骨症是最具代表性的,软骨损伤是该症的基本表现之一。软骨形成过程受到全身激素、细胞因子和局部信号通路的共同调控。生物钟是指生理学和行为的每日24小时节律,由外部时间线索产生的正、负反馈回路组成。正反馈回路由转录因子Clock和Bmal1组成,负反馈回路由转录因子Per和Cry组成。氟对软骨形成过程增殖、分化的影响以及氟是否通过生物钟信号通路调控软骨形成过程尚未见报道。为此,我们通过大鼠孕哺期染毒的初断乳仔鼠和小鼠ATDC5细胞,初步探索氟对ATDC5细胞体外分化过程的影响和生物钟信号通路在其中发挥的作用。本研究拟为阐明氟抑制长骨生长的机制提供线索,为氟骨症的防治提供理论依据。实验方法:本研究选取孕哺期染毒的Wistar初断乳仔鼠,通过免疫组织化学染色检测大鼠生长板软骨中Bmal1蛋白的表达。本研究采用CCK8法确定氟抑制ATDC5细胞增殖的染毒剂量,在胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠诱导剂的作用下诱导ATDC5细胞分化,采用阿利新蓝染色法... 

【文章来源】：中国医科大学辽宁省

【文章页数】：52 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

大鼠生长板软骨细胞Bmal1蛋白的免疫组化染色（20X）

中国医科大学硕士学位论文11图2ATDC5细胞的CCK8细胞活力检测及阿利新蓝染色（A）用不同浓度的NaF处理ATDC5细胞72h，采用CCK-8法检测细胞存活率。（B）用含或不含10-3MNaF的分化培养液分别培养ATDC5细胞7、14和21天。采用阿利新蓝染色法检测细胞内蛋白多糖的合成情况，并用体式显微镜对染色后细胞进行拍照（2X）。（C）6M盐酸胍裂解细胞并用酶标仪检测裂解液在650nm处的吸光度。实验结果以X±SD表示，*P<0.05，**P<0.01，n=3，比例尺为500μm。3.3.氟对小鼠ATDC5细胞分化标志因子的影响3.3.1.氟对小鼠ATDC5细胞分化标志因子mRNA的影响用含有ITS的分化培养液分别培养ATDC5细胞5、7、14和21天，采用实时荧光定量RCR法检测ATDC5细胞分化标志因子Sox9、Aggrecan、Col2a1、

中国医科大学硕士学位论文14图3ATDC5细胞各时点Sox9、Aggrecan、Col2a1、Ihh和Col10a1的mRNA和蛋白表达用含或不含10-3MNaF的分化培养液分别培养ATDC5细胞5、7、14和21天。（A）采用实时荧光定量PCR法检测Sox9、Aggrecan、Col2a1、Ihh和Col10a1的mRNA表达。（B）采用免疫印迹法检测Sox9、Col2a1、Ihh和Col10a1的蛋白表达。（C）以Gapdh为内参，定量对照组和染氟组细胞的蛋白表达。实验结果以X±SD表示，*P<0.05，**P<0.01，n=3，比例尺为500μm。3.4.氟对小鼠ATDC5细胞内CircadianClock信号通路的影响用含有ITS的分化培养液培养ATDC5细胞7天，采用实时荧光定量RCR法和免疫印迹法检测ATDC5细胞生物钟信号通路核心分子Bmal1、Clock、Per1和Cry1的mRNA和蛋白的表达。如图4（A）所示，与对照组相比，染氟组Bmal1和Clock的mRNA表达显著降低(P<0.05)，Cry1的mRNA表达显著升高(P<0.05)，Per1的mRNA表达没有变化。如图4（B）和4（C）所示，与对照组相比，染氟组Bmal1和Clock的蛋白表达显著降低（P<0.05)，Cry1和Per1的蛋白表达显著升高（P<0.05)。图4ATDC5细胞的Bmal1、Clock、Per1和Cry1的mRNA和蛋白表达用含或不含10-3MNaF的分化培养液培养ATDC5细胞7天。（A）采用实时荧光定量PCR

【参考文献】：
期刊论文
[1]氟对体外培养软骨细胞内质网的影响及SOD对氟的拮抗作用[J]. 于燕妮,蒙炳杰.  中国地方病学杂志. 2006(05)
[2]过量氟对实验大鼠软骨细胞分化及Ⅱ和Ⅹ型胶原表型表达的影响[J]. 许鹏,郭雄,姚建锋,张富军,耿冬,杜晓阳,蔡乾坤.  中华风湿病学杂志. 2002(04)
[3]过量氟化物对软骨损伤的研究进展[J]. 许鹏,郭雄.  国外医学(医学地理分册). 2001(01)

硕士论文
[1]Sedlin蛋白对人软骨细胞增殖的影响及作用机制[D]. 胡玉娟.重庆医科大学 2014



本文编号：3479441