白藜芦醇对高糖培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞SRIT1及NADPH氧化酶-p47蛋白表达的影响及机制研究

发布时间：2017-05-28 00:03

  本文关键词：白藜芦醇对高糖培养的大鼠胸主动脉平滑肌细胞SRIT1及NADPH氧化酶-p47蛋白表达的影响及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种无法治愈的慢性疾病。目前全球糖尿病的患病率逐年升高，其慢性大血管并发症包括高血压、冠心病、脑血管疾病及周围血管疾病，是糖尿病患者的主要健康威胁，尤其是心血管疾病已经成为糖尿病患者发病率和致死率最高、危害最大的慢性并发症之一。糖尿病大血管病变的主要病理基础是动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）。在高糖、炎症因子等刺激下，血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）激活，发生表型转化，由收缩型转化成合成型，迁移至内膜下层并大量增殖，是AS发生的关键环节。此外，高糖可促进血管内皮细胞活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成，如NADPH氧化酶(nicotinamide vadenine dinucleotide phosphateoxidase，NOX)、黄嘌呤氧化酶、线粒体呼吸链酶复合体、内皮型一氧化氮合酶及脂氧合酶等，其中NADPH氧化酶是血管内皮细胞ROS的主要来源，NADPH氧化酶是由p47phox、p67phox、p40phox、小G蛋白Rac1或Rac2五个亚基组成的酶复合体，其中p47是NADPH氧化酶的关键亚基，NADPH氧化酶亚单位表达及活性的改变在AS中扮演着重要角色。 白藜芦醇（Resveratrol，Res）因其多重生物活性倍受关注。白藜芦醇化学名称为3，4'，5-三羟基二苯乙烯(trans-3,4',5-trihybdroxystilbene)，是一种天然的多酚类化合物，存在于多种中草药和其他植物中。诸多研究表明，白藜芦醇具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降低血糖、减少血小板聚集、促进血管舒张、心血管保护以及对抗2型糖尿病及其相关并发症等作用。此外，白藜芦醇还可干预体外高糖培养的大鼠VSMCs的异常增殖。有报道称，Res能减弱高糖培养的大鼠VSMCs的异常增殖，其在一定程度上与SIRT1（NAD+依赖的去乙酰化酶）的表达相关。Res是目前最强的SIRT1的天然激活物，但白藜芦醇对于SIRT1及其相关信号通路在抑制高糖诱导的血管平滑肌细胞增殖作用的机制尚不明确。本实验以高糖诱导的大鼠胸主动脉平滑肌细胞为研究对象，，探讨白藜芦醇对VSMCs增殖活性的影响及其潜在作用靶点沉默信息调节子（SIRT1）抑制细胞内NADPH氧化酶-p47蛋白生成通路的作用，为防治糖尿病及其并发症提供新的理论依据。 方法： 1细胞培养的方法如下：用大鼠胸主动脉平滑肌细胞株A7r5(细胞株购自中国培养物典藏中心)作为研究对象。将冻存的血管平滑肌细胞株立刻投入37℃温水中，同时摇动冻存管使其快速解冻，解冻后以800转/min离心5min，弃上清，加入含20%FBS的DMEM培养基5ml并混匀，接种于培养瓶中，放置于37℃、5%CO2的孵箱中孵育，待细胞铺满瓶底的90%时进行传代。取处于对数生长期的细胞分别接种在50ml培养瓶和96孔培养板上，培养24小时后，再更换为无血清DMEM培养基继续培养24小时，让细胞处于饥饿状态且同步于G0/Gl期，然后分8组进行实验： ①正常对照组（control组）：5.5mmol/L葡萄糖 ②高糖培养组（25G组）：25mmol/L葡萄糖 ③高糖+SIRT1抑制剂组（25G+Sirtionl组）：25mmol/L葡萄糖+50μmol/L Sirtionl ④高糖+NADPH氧化酶抑制剂组（25G+Apocynin组）：25mmol/L葡萄糖+1mmol/LApocynin ⑤甘露醇对照组（Mannitol组）：5.5mmol/L葡萄糖+19.5mmol/L甘露醇 ⑥高糖+25R组（25G+25Res组）：25mmol/L葡萄糖+25μmol/L白藜芦醇 ⑦高糖+50R组（25G+50Res组）：25mmol/L葡萄糖+50μmol/L白藜芦醇 ⑧高糖+100R组（25G+100Res组）：25mmol/L葡萄糖+100μmol/L白藜芦醇 2采用MTT法检测高糖孵育下，不同浓度Res对VSMCs增殖活性的影响。 3采用流式细胞技术检测高糖孵育下，不同浓度Res对VSMCs细胞周期进程的影响。 4采用Western blot技术检测不同浓度Res对高糖孵育下VSMCs细胞SIRT1、NADPH氧化酶-p47蛋白表达的影响。 结果: 1采用MTT法检测VSMCs的增殖活性，结果显示：在高糖诱导下，VSMCs增殖显著（P＜0.05），而对高渗组细胞的增殖活性无明显影响；Res（25、50、100μmol/L）可显著抑制高浓度葡萄糖诱导的VSMCs增殖（P＜0.05），并呈浓度依赖性。 2采用流式细胞仪检测细胞周期时相分布情况，结果显示：高糖（25mmol/L）能够显著诱导G0/G1期细胞向S期的转化（P＜0.05），细胞周期进程在高渗对照组无明显改变；Res（25、50、100μmol/L）能够显著抑制高糖诱导下的G0/G1期细胞向S期的转化，G0/G1期细胞数目明显增多，S期细胞数目明显减少（P＜0.05）。 3Western blot技术检测白藜芦醇对VSMCs SIRT1、 NADPH氧化酶-p47蛋白表达量的影响，结果显示：高糖能使NADPH氧化酶-p47蛋白表达明显增加，SIRT1蛋白表达减少（P＜0.05）；用Apocynin预处理后，NADPH氧化酶受到抑制，NADPH氧化酶-p47蛋白表达减少，SIRT1蛋白表达增加（P＜0.05）；用Sirtionl预处理后，SIRT1受到抑制，SIRT1蛋白表达减少，NADPH氧化酶-p47蛋白表达增加；而高渗组无明显改变；Res（25、50、100μmol/L）能显著降低高糖环境下NADPH氧化酶蛋白的表达，增加SIRT1蛋白的表达，并呈浓度依赖性（P＜0.05）。 结论： 1高糖可促进体外培养的VSMCs的增殖，促使细胞由G0/G1期向S期转化。其机制可能是高糖激活SIRT1/NADPH氧化酶-p47蛋白信号通路，抑制SIRT1蛋白表达，促进p47蛋白表达，从而促进细胞增殖。高糖状态诱导的细胞异常增殖可能是糖尿病大血管病变的发病机制之一。 2白藜芦醇通过干预SIRT1/NADPH氧化酶-p47蛋白信号通路，使SIRT1蛋白表达上调，抑制NADPH氧化酶-p47蛋白表达，抑制VSMCs增殖，减少进入S期的细胞数目，使细胞阻滞在G0/G1期，且呈浓度依赖性。提示白藜芦醇可能通过SIRT1/NADPH氧化酶-p47蛋白信号通路干预高糖诱导的VSMCs的增殖，对2型糖尿病的大血管病变起到防治作用。
【关键词】：2型糖尿病 动脉粥样硬化 白藜芦醇 增殖 细胞周期 SIRT1 p47
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R587.1;R965
【目录】：

• 摘要4-8
• ABSTRACT8-12
• 前言12-14
• 材料与方法14-24
• 结果24-27
• 附图27-31
• 附表31-33
• 讨论33-38
• 结论38
• 参考文献38-43
• 综述 SIRT1研究现状43-54
• 参考文献48-54
• 致谢54-55
• 个人简历55

【参考文献】

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1 朱玉;杨菊红;王楠;李冰;王巍;赵荣兰;梁东春;冯凭;;自发性2型糖尿病大鼠腹主动脉SIRT1的表达及二甲双胍的干预研究[J];天津医科大学学报;2010年03期

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4 郜海燕;于震宇;陈杭君;陈文煊;张俊;毛金林;;白藜芦醇功能和作用机理研究进展[J];中国食品学报;2006年01期

5 赵占胜;王绵;梁江燕;谢峗;邓永贵;周红;王瑞英;张力辉;姚玉霞;丛斌;苏胜偶;;罗格列酮对高糖诱导大鼠血管平滑肌细胞炎症和增殖的影响[J];中国老年学杂志;2010年10期

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本文编号：401453