T_3对氧化应激诱导的HepG2细胞氧化还原状态及糖代谢的影响

发布时间：2017-05-28 23:00

  本文关键词：T_3对氧化应激诱导的HepG2细胞氧化还原状态及糖代谢的影响，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：代谢综合征（metabolic syndrome，MS）是以胰岛素抵抗为病理生理基础，伴有中心性肥胖、高血压和糖、脂代谢紊乱等严重影响人类健康的临床症候群。而氧化应激与MS的发生发展密切相关。甲状腺激素是维持机体基础代谢率、认知能力、糖脂代谢以及心血管正常状态的调节性激素。研究发现，甲状腺激素缺乏与机体氧化损伤，代谢紊乱密切相关。甲状腺激素，尤其是三碘甲状腺原氨酸（T3）的异常水平会改变参与葡萄糖和脂质的代谢的蛋白水平，从而引起胰岛素抵抗或高血糖。因此，探究T3抗氧化保护功能及对细胞糖代谢的影响对改善细胞胰岛素抵抗，调节糖代谢水平，进而对代谢综合征预防与治疗具有重要意义。本研究通过体外建立HepG2细胞氧化损伤模型，研究T3的抗氧化保护作用及机制，以及T3在调节胰岛素抵抗HepG2细胞糖代谢中的作用。 方法：体外建立HepG2细胞氧化损伤模型，包括H2O2损伤模型及高糖损伤模型。添加不同浓度T3（10-9M-10-5M）进行保护，测定T3对细胞ROS、存活率及细胞氧化还原指标（T-AOC、GSH/GSSG、GSH-Px、SOD、CAT、MDA）的影响。采用RT-PCR检测细胞GSK-3β、Nrf2信号通路中关键基因的表达，Western Blot检测GSK-3β磷酸化水平及Nrf2核质比变化。测定T3保护后损伤细胞的线粒体膜电位及凋亡因子Bcl-2、促凋亡因子Bax的表达。建立细胞胰岛素抵抗模型，检测T3对IR-HepG2细胞葡萄糖吸收的影响，采用RT-PCR检测T3对胰岛素信号通路关键基因（INSR、IRS1、PI3K、GLUT4、GSK-3β）及糖代谢中关键基因（HK、PK、GS、GLUT2）的表达的影响。 结果：(1)10-5M、10-7M及10-9M T3预处理可显著降低高损伤（200μM H2O2或44mM葡萄糖处理）、中等损伤（100μM H2O2或22mM葡萄糖处理）及低损伤（50μM H2O2处理）细胞的ROS水平，提高细胞存活率（p0.05），并可显著降低损伤细胞MDA含量，提高T-AOC、GSH/HSSG，增加GSH-Px、SOD及CAT活性（p0.05），提高Nrf2及上游调控因子PI3K、AKT，下游抗氧化酶基因HO-1、NQO1的表达，降低GSK-3β及Keap1表达。10-9M T3对正常培养基（5.5mM葡萄糖）处理的细胞自由基及存活率无显著影响，，但对酶活及抗氧化基因表达有提高作用。而10-5M T3会增加50μM H2O2及5.5mM葡萄糖培养细胞的ROS水平，降低存活率（p0.05），影响细胞氧化还原状态，降低Nrf2及相应基因表达，提高GSK-3β表达。(2)损伤细胞GSK-3βSer9磷酸化降低，Tyr216磷酸化增加，Nrf2核质比降低，T3可提高GSK-3βSer9磷酸化，降低GSK-3βTyr216磷酸化，提高Nrf2核质比，提高其抗氧化作用。(3) T3可提高损伤细胞的线粒体膜电位，提高Bcl-2表达，降低Bax表达，减轻细胞凋亡。但与T3抗氧化作用类似，也有剂量依赖关系，与T3的作用浓度及细胞状态相关。(4) IR-HepG2细胞糖吸收能力显著降低，T3可在一定程度上提高细胞糖吸收，而T3与胰岛素联合作用后细胞糖吸收可显著提高。T3可提高胰岛素信号通路关键因子的表达，也可影响HK、GS、GLUT2的表达，且T3与胰岛素配合使用对这些基因表达影响更大。 结论：(1) T3对氧化损伤的HepG2细胞的氧化还原状态具有明显的改善作用，可提高细胞抗氧化酶的活性。作用机制与影响GSK-3β/Nrf2通路基因的表达有关，具体为T3可通过提高GSK-3βSer9磷酸化，降低GSK-3βTyr216磷酸化抑制GSK-3β活性，从而促进Nrf2由细胞质转入细胞核，提高Nrf2核质比。(2) T3可抵抗细胞凋亡。(3) T3可增加细胞糖吸收，提高胰岛素作用，改善细胞糖代谢，有效改善细胞胰岛素抵抗。
【关键词】：甲状腺激素(T3) HepG2细胞 氧化还原状态 糖代谢
【学位授予单位】：江南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R589
【目录】：

• 摘要3-5
• Abstract5-7
• 中英文缩略语对照表7-10
• 1 绪论10-16
• 1.1 代谢综合征、氧化应激及肝脏代谢异常关系简介10-12
• 1.1.1 代谢综合征与氧化应激10-11
• 1.1.2 肝脏代谢异常与 MS11
• 1.1.3 肝脏代谢异常与氧化应激11
• 1.1.4 肝细胞功能与 GSK-3β/Nrf2 信号通路11-12
• 1.2 甲状腺激素及其研究进展12-15
• 1.2.1 甲状腺激素简介12-13
• 1.2.2 甲状腺激素与代谢综合征13
• 1.2.3 甲状腺激素与肝脏胰岛素抵抗相关研究13-14
• 1.2.4 T_3调节氧化还原状态研究现状14-15
• 1.3 立题意义及研究内容15-16
• 2 实验材料与方法16-21
• 2.1 实验材料及仪器16
• 2.1.1 实验原料和主要试剂16
• 2.1.2 实验主要仪器16
• 2.1.3 耗材16
• 2.2 实验方法16-21
• 2.2.1 细胞培养16-17
• 2.2.2 噻唑蓝(MTT)法检测细胞存活率17
• 2.2.3 ROS 探针法检测细胞自由基水平17
• 2.2.4 HepG2 细胞损伤模型的建立17
• 2.2.5 检测 T_3对氧化应激诱导的 HepG2 细胞 ROS 及存活率的影响17-18
• 2.2.6 检测 T_3对氧化应激诱导的 HepG2 细胞抗氧化物/酶的影响18
• 2.2.7 检测 T_3对氧化应激诱导的 HepG2 细胞线粒体膜电位的影响18
• 2.2.8 细胞总 RNA 提取及逆转录为 cDNA18-19
• 2.2.9 实时荧光定量 PCR19-20
• 2.2.10 细胞胰岛素抵抗模型的建立20
• 2.2.11 细胞葡萄糖利用率测定20
• 2.2.12 细胞蛋白 Western blot 检测20
• 2.2.13 数据统计20-21
• 3 结果与讨论21-41
• 3.1 T_3抗氧化作用21-32
• 3.1.1 HepG2 细胞 H2O2损伤模型的建立21
• 3.1.2 HepG2 细胞不同能量水平模型的建立21-22
• 3.1.3 T_3对氧化应激细胞 ROS 的影响22-23
• 3.1.4 T_3对氧化应激细胞存活率的影响23-25
• 3.1.5 T_3对氧化损伤细胞氧化还原状态的影响25-27
• 3.1.6 T_3对抗氧化相关基因 mRNA 的影响27-30
• 3.1.7 T_3抗氧化机制探究30-32
• 3.2 T_3对 HepG2 细胞凋亡的影响32-34
• 3.2.1 T_3对细胞线粒体膜电位的影响32-33
• 3.2.2 T_3对细胞凋亡相关基因的影响33-34
• 3.3 T_3对 HepG2 细胞糖代谢的调节34-40
• 3.3.1 T_3对氧化损伤细胞糖吸收的影响34-35
• 3.3.2 T_3对胰岛素的细胞糖吸收作用的影响35-36
• 3.3.3 T_3对细胞胰岛素信号通路相关基因表达的影响36-38
• 3.3.4 T_3对细胞糖代谢相关基因表达的影响38-40
• 3.4 讨论40-41
• 主要结论与展望41-42
• 主要结论41
• 展望41-42
• 致谢42-43
• 参考文献43-48
• 附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文48

【参考文献】

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本文编号：403594