Dishevelled-2通过交叉调控Wnt和NF-κB信号通路对骨代谢的作用机制研究

发布时间：2017-07-14 16:05

  本文关键词：Dishevelled-2通过交叉调控Wnt和NF-κB信号通路对骨代谢的作用机制研究

  更多相关文章： 类风湿关节炎 Dishevelled-2 Wnt/β-catenin信号通路 NF-κB信号通路 C2C12细胞 RAW264.7细胞

【摘要】：类风湿关节炎是最常见的自身免疫性疾病之一,以持续性关节内滑膜炎症引起的骨及软骨损害为特征。在我国致残性疾病中,位列第二位,且其发病率有逐年上升趋势。目前针对阻断关节炎症的治疗方法较多,但对于关节破坏的分子机制的研究尚不够明确,有效阻断关节破坏的的药物不多。研究表明,Wnt和NF-κB信号通路可分别作用于成骨和破骨细胞从而共同维持骨代谢动态平衡,干扰Wnt通路激活联合增强NF-κB通路激活能够抑制成骨细胞的增殖分化和促进破骨细胞的增殖分化,破坏骨代谢平衡,均参与类风湿关节炎的发生发展。Dishevelled(Dvl)一方面在Wnt通路发挥着重要的调控作用,另一方面亦参与NF-κB调控,我们研究发现Dvl在RA小鼠模型中关节局部呈高表达状态。因而,Dvl可能通过两条通路的共同作用,维持骨代谢平衡,对于Dvl对成骨细胞和破骨细胞作用机制的研究,将为RA的临床治疗提供新的实验室证据。一、研究目的本研究选取C2C12细胞系和RAW264.7细胞系作为研究对象,通过转染携带Dvl-2的基因表达质粒和Dvl-2-si RNA干扰序列,检测Wnt和NF-κB信号通路活性及OPG、RANKL、胞内β-catenin及IκB-α表达量的变化,初步探讨Dvl-2通过交叉调控经典Wnt/β-catenin和NF-κB信号通路,对成骨细胞和破骨细胞增殖分化的影响。二、研究方法首先,采用Lipofectamine 2000法瞬时转染Dvl-2过表达质粒及Dvl-2-si RNA干扰片段,上调或下调细胞内Dvl-2的表达量,通过荧光显微镜观察和Real-time PCR及Western blot方法检测转染效果。然后,通过CCK8法检测Dvl-2对C2C12细胞及RAW264.7细胞增殖能力的影响。C2C12细胞予以相应处理后收集上清液,通过ELISA技术检测C2C12细胞中骨保护素的分泌情况。Western blot法检测C2C12细胞内RANKL蛋白的表达量和通路下游细胞内β-catenin的含量。通过将TCF报告基因质粒或κB-Luc报告基因质粒和PRL-SV40报告质粒共转染,利用Glo Max 20/20发光检测仪分别检测Wnt及NF-κB信号通路的激活状态。Western blot法检测NF-κB相关靶基因IκB-α的表达量。采用蛋白免疫共沉淀测定Dvl-2能否与p65的结合。最后,采用SPSS18.0统计软件对所得数据进行统计分析。三、研究结果1.细胞分别转染Dvl-2过表达质粒或Dvl-2-si RNA干扰片段,转染36h后,荧光显微镜下观察到细胞免疫荧光的表达;采用PCR和Western blot方法检测结果一致,与对照组相比,Dvl-2过表达组Dvl-2表达量升高,Dvl-2-si RNA组Dvl-2表达量降低。2.CCK8检测结果显示,与空白质粒组相比,Dvl-2过表达组C2C12细胞增殖能力并无显著变化;RAW264.7细胞增殖能力降低。3.C2C12细胞分别给予相应处理48h后,采用ELISA法测定上清液OPG浓度,结果显示Dvl-2、Wnt3a单独刺激均可上调OPG的浓度,与对照组相比有显著性差异,且Dvl-2上调OPG分泌的能力高于Wnt3a;转染si RNA下调Dvl-2表达后,OPG浓度较对照组降低。4.同样,质粒转染48h后,Western blot检测结果显示,Dvl-2过表达组C2C12细胞RANKL蛋白表达量较对照组降低,转染si RNA抑制Dvl-2表达后,RANKL蛋白表达量较对照组升高。5.TCF报告基因质粒和Dvl-2基因表达质粒共转染后,双荧光素酶报告基因检测结果显示单独Dvl-2、Wnt3a均可激活TCF报告基因质粒,两者共刺激组TCF报告基因质粒激活程度更高。Dvl-2-si RNA组TCF报告基因质粒活性较对照组降低。6.Western blot检测显示相对于空白质粒组,Dvl-2过表达组β-catenin含量也有所升高;下调Dvl-2表达后,β-catenin蛋白含量降低。7.在RAW264.7细胞,双荧光素酶报告基因检测显示,与空白质粒组相比,Dvl-2过表达组κB-Luc报告基因活性降低,两者有显著性差异,下调Dvl-2表达后,κB-Luc报告基因活性升高;同时Dvl-2可下调NF-κB相关靶基因IκB-α的表达。8.为明确Dvl-2抑制NF-κB信号通路的机制,采用Dvl-2与p65蛋白免疫共沉淀结果显示Dvl-2可与p65特异性结合。四、结论1.Dvl-2对C2C12细胞增殖无影响;Dvl-2过表达可抑制RAW264.7细胞增殖;2.Dvl-2通过经典Wnt/β-catenin通路促进C2C12细胞OPG的分泌,Dvl-2上调OPG分泌的能力高于Wnt3a,一方面可促进成骨细胞分化;另一方面Dvl-2可下调C2C12细胞RANKL的表达量,影响OPG/RANKL比值,通过NF-κB主导的RANK-RANKL-OPG信号通路抑制破骨细胞的成熟分化;3.Dvl-2可激活经典Wnt/β-catenin信号通路,促进胞内β-catenin蛋白稳定;4.Dvl-2通过与p65结合可直接抑制RAW264.7细胞NF-κB通路激活,下调相关靶基因IκB-α的表达,抑制破骨前体细胞成熟分化。
【关键词】：类风湿关节炎 Dishevelled-2 Wnt/β-catenin信号通路 NF-κB信号通路 C2C12细胞 RAW264.7细胞
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R593.22
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-11
• 缩略词表11-12
• 前言12-15
• 课题设计15-17
• 实验材料与方法17-28
• 一、材料17-20
• 二、实验方法20-28
• 实验结果28-37
• 讨论37-39
• 结论39-40
• 参考文献40-43
• 文献综述43-53
• 综述参考文献49-53
• 在读期间发表论文及科研情况53-54
• 致谢54

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本文编号：541704