BAFF-BAFF-R及其信号转导参与佐剂性关节炎大鼠的免疫反应及芍药苷-6’-O-苯磺酸酯的作用

发布时间：2017-07-20 02:21

  本文关键词：BAFF-BAFF-R及其信号转导参与佐剂性关节炎大鼠的免疫反应及芍药苷-6’-O-苯磺酸酯的作用

  更多相关文章： CP-25 CD45R~+B 细胞 佐剂性关节炎 B 淋巴细胞刺激因子 BAFF-RTRAF2 Bax Bcl-2

【摘要】：B细胞活化因子(B cell activating factor, BAFF)又称B细胞刺激因子,是肿瘤坏死因子配体超家族成员之一,主要来源于骨髓家族细胞如单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等。与其受体B细胞活化因子受体(B cell-activating factor receptor, BAFF-R)、跨膜激活剂及钙调亲环素配体相互作用分子(transmembrane activator or calcium-modulating cyclophylin ligand-interactor, TACI)、B细胞成熟抗原(B cell maturation antigen, BCMA)结合,促进B细胞的存活、生长、抗原递呈以及不同阶段免疫球蛋白的类别转换和重组,在B细胞存活、增殖和活化中起重要作用。白芍总苷(total glucosides of paeony, TGP)是我国批准上市治疗RA的抗炎免疫调节药,在临床治疗中发挥良好疗效,不良反应少,但起效较慢,疗效较弱,可能与生物利用度差有关。课题组合成了芍药苷-6-氧-苯磺酸酯(代号CP-25),其是TGP有效活性成份芍药苷(paeoniflorin, Pae)的结构修饰单体。前期研究表明,与Pae相比,CP-25脂溶性好,生物利用度明显提高,抗炎免疫调节作用明显,已获中国发明专利(ZL 2012 10030616.4)。但CP-25对BAFF及其受体介导的类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)免疫应答及其机制尚不清楚。本研究以大鼠佐剂性关节炎(adjuvant-induced arthritis, AA)模型为研究对象,观察BAFF及其受体BAFF-R信号转导在大鼠AA免疫反应的作用,探讨CP-25对大鼠AA的治疗作用是否与其调控淋巴细胞BAFF及其受体BAFF-R信号转导有关。目的：部分揭示BAFF及其受体BAFF-R信号转导参与了大鼠AA免疫反应,明确CP-25对大鼠AA的治疗作用与其调控淋巴细胞BAFF及其受体BAFF-R信号转导有关,为揭示CP-25治疗RA的机制提供实验依据。方法：将完全弗氏佐剂(complete Freund adjuvant, CFA)0.1ml于SD大鼠右后足跖皮内注射,制备大鼠AA模型。正常组同法注射生理盐水代替CFA以作为对照。将造模成功的SD大鼠随机分为八组：正常组,模型组,CP-25(25,50,100mg/kg)治疗组,甲氨蝶呤(methotrexate, MTX)(0.5mg/kg)、TGP(50mg/kg)和Pae(50mg/kg)阳性对照组。足爪肿胀数测定；脾脏及胸腺指数测定；ELISA法检测血清和细胞上清中BAFF和IgM水平；CCK-8测定脾脏淋巴细胞的增殖反应；流式细胞术检测BAFF-R、TACI、BCMA在脾脏组织CD45R+B细胞的表达；Q-PCR检测BAFF-R在脾脏中mRNA的表达；Western Blot法及免疫组织化学法检测BAFF-R、TRAF2、Bax、Bcl-2在脾脏中蛋白表达；结果：1.AA大鼠在炎症免疫反应不同阶段血清中BAFF、IgM水平变化与正常组比较,炎症免疫反应期(D9)AA大鼠血清中BAFF水平明显增高,关节炎初期(D16)、关节炎高峰期(D23)、及关节炎缓解期(D30)大鼠血清中BAFF有上升趋势,但无显著性差异； AA大鼠各时期血清中IgM水平均显著高于正常组大鼠。2. BAFF三个受体BAFF-R、TACI、BCMA在AA大鼠脾脏CD45R+B细胞中的表达与正常组相比,BAFF-R在AA大鼠脾脏CD45R+B细胞中表达明显升高,BCMA、TACI表达无明显变化；Q-PCR法检测显示BAFF-R mRNA在AA大鼠脾脏中表达明显升高；Western Blot法及免疫组织化学法检测显示,与正常组相比,BAFF-R在AA大鼠脾脏组织中表达明显升高。3.CP-25灌胃给药对AA大鼠足爪肿胀数及免疫器官指数的影响CFA诱导大鼠AA模型,继发病变在造模后14天,表现为以多发性关节炎为特征的关节肿胀变形和活动障碍,在造模后21天左右达到炎症高峰。CP-25各剂量组可以减轻大鼠关节肿胀,降低大鼠的关节肿胀数。与正常组相比,AA大鼠脾脏明显肿大,脾脏指数显著增高；CP-25各剂量组均不同程度降低AA大鼠脾脏指数,具有明显抑制作用；AA大鼠胸腺指数无明显变化,各给药组无明显影响。4.CP-25灌胃给药对AA大鼠脾脏淋巴细胞功能的影响AA模型组大鼠血清中IgM及淋巴细胞增殖水平较正常组明显增高,CP-25(25,50,100mg/kg)均能够显著降低大鼠血清中IgM水平,显著抑制LPS诱导的大鼠淋巴细胞增殖。5.CP-25灌胃给药对AA大鼠脾脏BAFF-R表达的影响模型组大鼠脾脏BAFF-R水平较正常组显著增高；CP-25(25,50, 100mg/kg)均能不同程度降低大鼠脾脏BAFF-R mRNA水平；免疫组化法及Western Blot法检测发现,与正常组比较,模型组大鼠脾脏BAFF-R蛋白高表达,CP-25(25,50,100mg/kg)给药不同程度降低AA大鼠脾脏BAFF-R蛋白表达。6.CP-25体外对BAFF刺激的正常大鼠脾脏淋巴细胞功能的影响BAFF(500ng/ml)体外刺激正常大鼠脾脏淋巴细胞48h,大鼠脾脏淋巴细胞IgM水平明显上调,脾脏淋巴细胞的增殖显著增加；CP-25(10-9,10-7,10-6mol/L)给药后可以不同程度降低IgM水平,抑制脾脏淋巴细胞增殖。7.CP-25体外对BAFF刺激正常大鼠脾脏淋巴细胞BAFF-R、TRAF2、Bax、Bcl-2表达变化的影响BAFF(500ng/ml)体外刺激正常大鼠脾脏淋巴细胞48h,其BAFF-R、TRAF2、Bcl-2表达显著增加, Bax表达降低；CP-25(10-6mol/L)可以显著降低BAFF-R、 TRAF2、Bcl-2表达,增加Bax表达。结论：1.AA大鼠的炎症继发性病变致炎后d14左右开始出现,至d21达到高峰,其继发侧足爪出现肿胀；脾脏指数增高,血清BAFF、IgM水平较正常大鼠增高；脾脏淋巴细胞增殖增加；脾脏CD45R+B细胞上BAFF-R表达增加。其胸腺指数,脾脏CD45R+B细胞上TACI、BCMA表达则无明显变化。2. BAFF刺激正常大鼠脾脏淋巴细胞后,脾脏淋巴细胞IgM水平增高,增殖增加；脾脏淋巴细胞上BAFF-R、TRAF2、Bcl-2表达增加,Bax表达降低。3.CP-25灌胃给药可以降低AA大鼠的足爪肿胀数,改善免疫器官指数,下调血清IgM水平,抑制脾脏淋巴细胞增殖,下调脾脏CD45R+B细胞上BAFF-R表达；CP-25体外给药可以下调BAFF刺激的脾脏淋巴细胞IgM水平,抑制脾脏淋巴细胞增殖,下调脾脏淋巴细胞BAFF-R、TRAF2、Bcl-2表达,上调Bax表达。提示CP-25对大鼠AA的治疗作用与其调控淋巴细胞BAFF及其受体BAFF-R信号转导有关。
【关键词】：CP-25 CD45R~+B 细胞 佐剂性关节炎 B 淋巴细胞刺激因子 BAFF-RTRAF2 Bax Bcl-2
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R593.22
【目录】：

• 英文缩略词对照(Abbreviation)7-9
• 中文摘要9-13
• Abstract13-18
• 1 前言18-19
• 2 实验材料19-20
• 2.1 动物19
• 2.2 药物19
• 2.3 试剂19-20
• 2.4 仪器与设备20
• 3. 实验方法20-28
• 3.1 大鼠AA模型的建立20-21
• 3.2 动物分组及给药方法21
• 3.2.1 AA大鼠炎症免疫反应不同阶段分组21
• 3.2.2 AA大鼠给药分组及给药方法21
• 3.3 足爪肿胀数测定21
• 3.4 免疫器官指数检n,21
• 3.5 流式细胞术检n,BAFF-R、TACI、BCMA在牌脏CD45R、细胞上的表达21-22
• 3.6 细胞上清及血清中细胞因子水平的检n,22
• 3.7 大鼠脾脏淋巴细胞增殖反应的检测22
• 3.8 大鼠脾脏组织和脾脏淋巴细胞中BAFF-R mRNA表达的测定22-24
• 3.8.1 大鼠脾脏组织总RNA的提取22-23
• 3.8.2 逆转录23-24
• 3.8.3 Q-PCR24
• 3.9 脾脏组织和脾脏淋巴细胞中BAFF-R、TRAF2、Bax、Bcl-2蛋白表达测定24-28
• 3.9.1 免疫组织化学方法24-25
• 3.9.2 蛋白印迹实验方法25-28
• 3.10 统计学处理28
• 4. 实验结果28-43
• 4.1 AA大鼠在炎症免疫反应不同阶段血清BAFF、IgM水平变化28-29
• 4.2 BAFF三个受体BAFF-R、TACI、BCMA在AA大鼠脾脏CD45R~+B细胞中的表达29-30
• 4.3 CP-25整体给药对AA大鼠足爪肿胀数及免疫器官指数的影响30-33
• 4.3.1 CP-25对AA大鼠足爪肿胀数的影响30-32
• 4.3.2 CP-25对AA大鼠免疫器官指数的影响32-33
• 4.4 CP-25灌胃给药对AA大鼠脾脏淋巴细胞功能的影响33-35
• 4.4.1 CP-25对AA大鼠血清中IgM分泌水平的影响33-34
• 4.4.2 CP-25对AA大鼠脾脏淋巴细胞增殖功能的影响34-35
• 4.5 CP-25灌胃给药对AA大鼠脾脏BAFF-R表达的影响35-38
• 4.5.1 CP-25对AA大鼠脾脏BAFF-R mRNA表达的影响35-36
• 4.5.2 CP-25对AA大鼠脾脏BAFF-R蛋白表达影响36-38
• 4.6 CP-25体外对BAFF刺激的正常大鼠脾脏淋巴细胞功能的影响38-40
• 4.6.1 CP-25体外对BAFF刺激的正常大鼠脾脏淋巴淋巴细胞IgM分泌的影响38-39
• 4.6.2 CP-25体外对BAFF刺激的正常大鼠脾脏淋巴细胞增殖功能的影响39-40
• 4.7 CP-25体外对BAFF刺激正常大鼠脾脏淋巴细胞BAFF-R、TRAF2、Bax、Bcl-2表达变化的影响40-43
• 4.7.1 CP-25体外对BAFF刺激的正常大鼠脾脏淋巴细胞BAFF-R的影响40-41
• 4.7.2 CP-25体外对BAFF刺激的正常大鼠脾脏细胞TRAF2的影响41-42
• 4.7.3 CP-25体外对BAFF刺激的正常大鼠脾脏细胞Bax、BCl-2的影响42-43
• 5 讨论43-47
• 5.1 BAFF-BAFF-R在大鼠AA发生发展中具有重要作用43
• 5.2 BAFF-BAFF-R及其TRAF2-Bax/Bcl-2信号转导调控淋巴细胞功能参与大鼠AA发生发展43-45
• 5.3 CP-25对大鼠AA的治疗作用与其调节BAFF-BAFF-R-TRAF2-Bax/Bcl-2信号转导、控制淋巴细胞功能有关45-47
• 6 结论47-48
• 7 参考文献48-53
• 附录53-55
• 致谢55-57
• 综述57-68
• 参考文献62-68

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 李影;陈镜宇;张玲玲;魏伟;;肿瘤坏死因子受体相关因子参与炎症免疫调节的研究进展[J];中国药理学通报;2015年09期

2 王春;袁君;魏伟;;芍药苷-6-O'-苯磺酸酯体外降解动力学研究[J];安徽医科大学学报;2014年09期

3 王春;袁君;魏伟;;芍药苷-6-O'-苯磺酸酯理化性质研究[J];安徽医科大学学报;2014年02期

4 黄蓓;汪庆童;刘亢亢;姜玲;魏伟;;类风湿关节炎发生发展中TNF-α信号通路与CD4~+T细胞的关系[J];中国药理学通报;2013年07期

5 宋珊珊;张玲玲;魏伟;;实验性关节炎动物模型建立及病理机制研究进展[J];中国药理学通报;2011年12期

6 刘磊;孙策;张二中;;白芍总苷治疗未分化性关节炎的前瞻性研究[J];航空航天医药;2010年05期

7 ;TRAF-mediated regulation of immune and inflammatory responses[J];Science China(Life Sciences);2010年02期

8 王芬,徐建华,徐胜前,刘爽,孙桂华,张锐;白芍总苷治疗类风湿关节炎Ⅳ临床试验研究[J];安徽医科大学学报;2001年04期

，

本文编号：565875