SUMO化修饰酶PIASy对高糖诱导的大鼠肾系膜细胞NF-κB信号的调控研究

发布时间：2017-08-03 11:22

  本文关键词：SUMO化修饰酶PIASy对高糖诱导的大鼠肾系膜细胞NF-κB信号的调控研究

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【摘要】：目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病一种严重的微血管并发症,其发病机制不清,糖代谢和肾脏血流动力学异常所致的病理生理改变是糖尿病肾病发生的基础。在糖尿病肾病早期肾组织中可见单核巨噬细胞浸润,核因子-κB(neclear factor-κB,NF-κB)等大量炎症因子产生增加,提示炎症反应是DN发病的关键环节。而NF-κB作为炎症调节的关键核转录因子又受多种蛋白质翻译后修饰调节,如磷酸化、泛素化、小泛素化修饰物(small ubiquitin-related modifier protein,SUMO)修饰。SUMO化修饰是通过蛋白-蛋白相互作用而赋予靶蛋白新的生物特性。它通过加强蛋白质稳定、DNA修复、核质运输、信号转导、转录调控,从而调控靶蛋白。蛋白质的SUMO化修饰通过E1活化酶、E2结合酶、E3连接酶作用完成对靶细胞的修饰。其中E3连接酶是底物识别的关键酶,而PIAS家族是一类E3连接酶,它可加强底物的SUMO化修饰或是作为构架蛋白来调控关键信号分子的转录活性。有研究发现PIASy可诱导IκB激酶γ(IκB kinase,IKKγ)发生SUMO化,从而激活NF-κB信号通路。但目前在糖尿病肾病中,SUMO化修饰酶PIASy是否参加NF-κB信号调控研究尚少。因此本实验通过观察不同时间和浓度的高糖刺激大鼠肾系膜细胞后,观察SUMO化修饰酶PIASy、NF-κB信号激活关键信号分子(IκBα、p-IκBα、p-NF-κBp65、IKKγ)和下游炎症因子白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1,MCP-1)的表达,再通过细胞转染PIASy-si RNA干扰PIASy后再次观察NF-κB信号关键因子的改变,同时观察PIASy和IKKγ的细胞定位,旨在探讨SUMO化修饰酶PIASy对高糖介导的大鼠肾系膜细胞的NF-κB信号通路的调控作用和可能机制,为糖尿病肾病的防治提供新的特异性靶点。方法:(1)细胞的培养与分组:体外培养大鼠肾小球系膜细胞,以高糖作为刺激因子,分为以下三组:(1)正常对照组(NC组):培养基含5.6 mmol/L葡萄糖;(2)高糖干预组(HG组):按照培养基葡萄糖浓度梯度分3个组,HG1组:培养基含10 mmol/L葡萄糖;HG2组:培养基含20mmol/L葡萄糖;HG3组:培养基含30 mmol/L葡萄糖;(3)渗透压对照组(OP组):培养基含5.6 mmol/L葡萄糖+24.4mmol/L甘露醇。(2)各组细胞培养6h、12h、24h、48h、72h后,用Western-blot检测PIASy、IκBα、p-IκBα、p-NF-κB的蛋白表达,ELISA检测培养上清液IL-6、MCP-1浓度。(3)PIASy的RNA干扰研究:筛选出最佳高糖作用浓度和时间后,细胞转染PIASy-si RNA,再次进行分组::(1)si NC组:细胞转染control-si RNA加入含5.6mmol/L葡萄糖培养基培养;(2)si PIASy组:细胞转染PIASy-si RNA加入含5.6 mmol/L葡萄糖培养基培养;(3)HG+si NC:细胞转染control-si RNA加入含30 mmol/L葡萄糖培养基作用24h;(4)HG+si PIASy组:细胞转染PIASy-si RNA加入含30 mmol/L葡萄糖培养基作用24h。(4)采用免疫荧光染色检测PIASy和IKKγ在细胞中的表达及定位。(5)统计学分析:采用SPSS16.0统计软件进行数据处理分析。符合正态分布的计量资料以x±s表示,多组间均数比较采用单因素方差分析,组间多重比较用LSD-t法。P0.05为差异有统计学意义。结果:1.与NC相比,高糖可以刺激PIASy蛋白和m RNA表达(P0.05),且呈一定时间浓度依赖性。2.与NC相比,高糖可以降低IκBα、增加p-IκBα和p-NF-κB蛋白表达(P0.05),且具有一定时间浓度依赖性。3.不同时间和浓度的高糖刺激未改变IKKγ的m RNA和蛋白表达(P0.05),高糖诱导PIASy和IKKγ在细胞同一位置的黄色荧光表达增强。4.高糖可增加系膜细胞上清液IL-6、MCP-1的水平,并呈时间浓度依赖性增强(P0.05)。5.细胞转染PIASy-si RNA后成功抑制PIASy表达(P0.05)。与si NC组相比,si PIASy组显示IκBα表达显著增强、p-IκBα和p-NF-κB则显著减弱(P均0.05)。6.细胞转染PIASy-si RNA后,与si NC组比较显示IL-6、MCP-1浓度显著下调。结论:1.高糖可使肾系膜细胞PIASy表达上调。2.高糖可抑制IκBα、激活NF-κB,上调下游炎症因子的表达。3.高糖通过系膜细胞PIASy诱导NF-κB的活化并且促进下游炎症因子的表达,PIASy上调可能是糖尿病肾病NF-κB炎症信号激活的重要机制。
【关键词】：糖尿病肾病 炎症 SUMO化修饰酶PIASy 核因子-κB
【学位授予单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R692.9
【目录】：

• 摘要4-7
• Abstract7-11
• 前言11-14
• 材料与方法14-32
• 结果32-55
• 讨论55-64
• 结论64-65
• 参考文献65-70
• 英汉缩略词表70-71
• 致谢71-72
• SUMO化修饰酶对NF-κB信号通路的调控 综述72-82
• 参考文献79-82

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