桥本氏甲状腺炎中IL-23通过抑制细胞自噬诱导ROS累积的研究

发布时间：2017-08-07 21:32

  本文关键词：桥本氏甲状腺炎中IL-23通过抑制细胞自噬诱导ROS累积的研究

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【摘要】：目的:本文旨在探讨在桥本氏甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis,HT)患者中白细胞介素23(interlukin-23,IL-23)是否参与甲状腺氧化还原平衡紊乱以及ROS累积,其机制是否与诱导细胞自噬异常有关。方法:1.采用免疫组织化学法检测10例HT和10例单纯结节性甲状腺肿患者的甲状腺组织中IL-23、IL-23R表达。2.采用免疫荧光染色技术观察经不同浓度IFN-γ(250 U/mL、500 U/mL、1000 U/mL)或不同浓度LPS(0.1μg/mL、0.5μg/mL、1μg/m L)或不同浓度TNF-α(10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL)处理后甲状腺上皮细胞Nthy-ori 3-1中IL-23R的表达变化。3.甲状腺上皮细胞株Nthy-ori 3-1用不同浓度IL-23(0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL)单独处理或用特异性IL-23中和抗体预处理后再与IL-23(50 ng/mL)共同处理后,采用免疫荧光以及流式细胞术检测甲状腺上皮细胞内ROS水平的变化。4.采用免疫组织化学法检测桥本甲状腺炎以及单纯结节性甲状腺肿患者的甲状腺组织中自噬相关蛋白LC3B、Atg12表达。5.Western blot检测甲状腺上皮细胞经IL-23(50 ng/mL)单独处理不同时间(8min、15 min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h)或50 ng/ml IL-23与其特异性中和抗体(1μg/mL)共同作用后自噬相关蛋白LC3B、Atg12、p62表达变化。6.采用免疫荧光技术检测不同浓度IL-23(0 ng/mL、10 ng/mL、50 ng/mL)处理甲状腺上皮细胞24 h后p-mTOR表达变化。7.Western blot检测甲状腺上皮细胞经IL-23(50 ng/mL)处理不同时间(8 min、15min、30 min、1 h、3 h、6 h、12 h)后AKT、p-AKT以及mTOR、p-mTOR蛋白表达变化。8.甲状腺上皮细胞在含有或不含有il-23特异性中和抗体(1μg/ml)预处理的培养基中与il-23(50ng/ml)处理后,采用westernblot检测p-mtor以及mtor蛋白表达变化。9.westernblot检测甲状腺上皮细胞nthy-ori3-1经不同浓度雷帕霉素(10nm、20nm、50nm)处理不同时间段(12h、24h)后p-mtor表达水平变化。10.westernblot检测细胞经il-23(50ng/ml)与雷帕霉素(10nm)不同组合处理后自噬相关蛋白lc3b-ii、atg12以及p62表达变化。11.采用免疫荧光以及流式细胞术检测雷帕霉素的加入对甲状腺上皮细胞内ros表达水平的影响。12.免疫组化检测桥本甲状腺炎以及单纯结节性甲状腺肿患者甲状腺组织中p-akt、akt以及p-mtor、mtor的表达。结果:1.桥本氏甲状腺炎患者甲状腺组织中il-23以及il-23r表达明显高于正常对照组。2.体外实验结果显示,nthy-ori3-1经ifn-γ(250u/ml、500u/ml、1000u/ml)以及lps(0.1μg/ml、0.5μg/ml浓度)处理后细胞表面il-23r的表达量均明显上调,但不同浓度tnf-α处理组il-23r表达水平与对照组无明显差异。3.nthy-ori3-1经不同浓度il-23处理后其细胞内ros表达水平明显增强,il-23中和抗体的加入减少了il-23诱导的细胞内ros的增加。4.免疫组化结果显示,在桥本氏甲状腺炎患者的甲状腺组织中自噬相关蛋白lc3b、atg12表达明显低于正常对照组;体外实验显示,甲状腺上皮细胞经il-23处理后其自噬相关蛋白lc3b、atg12表达明显下调及p62蛋白表达上调(p0.01);相反,il-23中和抗体的加入使得自噬相关蛋白lc3b(p0.05)、atg12(p0.01)表达明显上调及p62表达明显下调(p0.01)。5.免疫荧光结果显示,il-23处理甲状腺上皮细胞后引发磷酸化mtor表达水平增加且具有一定浓度依赖性;采用westernblot技术在蛋白水平进一步验证,结果显示Nthy-ori 3-1经IL-23处理不同时间后AKT以及mTOR的磷酸化水平明显上调(P0.05),加入IL-23中和抗体后则p-mTOR表达水平明显下降(P0.05)。6.Western blot结果显示,10 nM雷帕霉素处理甲状腺上皮细胞24 h时,明显下调了mTOR以及p-mTOR水平。7.Western blot结果显示,与IL-23单独处理组相比,雷帕霉素的加入使得自噬相关蛋白LC3B、Atg12表达明显上调及p62蛋白表达明显下调;免疫荧光以及流式细胞术结果显示,与IL-23单独处理组相比,雷帕霉素的加入明显下调了ROS的表达(P0.01)。8.免疫组化结果显示,与健康对照组相比,桥本氏甲状腺炎患者的甲状腺上皮细胞中p-AKT以及p-mTOR表达水平明显上调,然而在正常对照组以及桥本甲状腺炎患者中总的AKT以及mTOR表达水平没有明显的差异。结论:综上所述,我们的结果显示桥本甲状腺炎患者的甲状腺上皮细胞中IL-23表达明显增高;IL-23通过活化AKT/mTOR信号通路抑制甲状腺上皮细胞自噬活性,自噬的抑制导致ROS水平的累积并进一步加剧桥本甲状腺炎疾病进程。因此,采用IL-23特异性中和抗体抑制IL-23或者雷帕霉素抑制mTOR的表达均明显反转了甲状腺上皮细胞自噬表型,且体外实验结果显示其相关蛋白的变化与桥本甲状腺炎患者甲状腺组织中蛋白变化较为一致,推测IL-23作为关键致病因子,与桥本甲状腺炎的发生发展密切相关,从而为阻止桥本甲状腺炎中甲状腺上皮细胞氧化损伤提供了潜在的治疗策略。
【关键词】：桥本氏甲状腺炎 IL-23 自噬 ROS AKT mTOR
【学位授予单位】：江苏大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R581.4
【目录】：

• 摘要5-8
• ABSTRACT8-16
• 英文缩略词16-19
• 第一章 绪论19-25
• 1.1 自身免疫性甲状腺疾病19-20
• 1.1.1 自身免疫性甲状腺疾病简介19
• 1.1.2 桥本氏甲状腺炎19-20
• 1.1.2.1 桥本氏甲状腺炎主要病理特征19-20
• 1.1.2.2 主要临床表现20
• 1.1.2.3 研究现状20
• 1.2 活性氧20-22
• 1.2.1 活性氧简介20-21
• 1.2.2 活性氧与炎症21
• 1.2.3 活性氧与桥本氏甲状腺炎21-22
• 1.3 自噬22-23
• 1.3.1 自噬简介22
• 1.3.2 自噬与自身免疫性疾病22-23
• 1.3.3 自噬与桥本氏甲状腺炎23
• 1.4 白细胞介素 2323-25
• 1.4.1 细胞因子与桥本氏甲状腺炎23-24
• 1.4.2 IL-23 与自身免疫性疾病24
• 1.4.3 IL-23 与桥本氏甲状腺炎24-25
• 第二章 研究目的、内容、方法、意义及实验方案设计25-27
• 2.1 研究目的25
• 2.2 研究内容25
• 2.3 研究方法及技术25
• 2.4 研究意义25
• 2.5 实验方案设计25-27
• 2.5.1 桥本氏甲状腺炎患者甲状腺组织与正常甲状腺组织中IL-23、IL-23R以及自噬相关蛋白Atg12、LC3B、p-AKT、AKT、p-m TOR、m TOR的表达情况25-26
• 2.5.2 IL-23 对甲状腺上皮细胞株Nthy-ori 3-1 自噬及细胞内ROS水平的影响及其分子机制的研究26-27
• 第三章 实验材料与方法27-41
• 3.1 临床标本收集27
• 3.1.1 桥本甲状腺炎及正常对照组甲状腺组织标本27
• 3.2 主要试剂和材料27-33
• 3.2.1 细胞株27
• 3.2.2 相关抗体及主要试剂27-32
• 3.2.2.1 细胞培养试剂27-28
• 3.2.2.2 蛋白提取试剂28-29
• 3.2.2.3 Western blot主要抗体及相关试剂29-31
• 3.2.2.4 免疫组化、免疫荧光相关试剂31-32
• 3.2.2.5 实验相关检测试剂盒32
• 3.2.3 主要仪器设备和耗材32-33
• 3.3 实验方法33-40
• 3.3.1 免疫组织化学34-35
• 3.3.2 细胞培养35
• 3.3.3 细胞内活性氧检测35-37
• 3.3.4 免疫荧光37-38
• 3.3.5 免疫印迹38-40
• 3.4 统计学分析40-41
• 第四章 实验结果41-55
• 4.1 HT甲状腺组织中IL-23 以及IL-23R表达情况的研究41-42
• 4.2 IFN-γ、LPS促进甲状腺上皮细胞IL-23R的表达42-43
• 4.3 IL-23 促进甲状腺上皮细胞中ROS的积聚43-45
• 4.4 IL-23 抑制甲状腺上皮细胞自噬45-48
• 4.4.1 桥本氏甲状腺炎患者甲状腺组织中自噬相关蛋白LC3B、Atg12表达水平明显下降45-46
• 4.4.2 IL-23 抑制甲状腺上皮细胞自噬46-47
• 4.4.3 添加靶向结合IL-23 的特异性中和抗体前后自噬变化47-48
• 4.5 IL-23 通过活化AKT/m TOR信号通路抑制甲状腺上皮细胞自噬活性48-52
• 4.5.1 IL-23 上调甲状腺上皮细胞AKT/m TOR信号通路相关蛋白的表达48-49
• 4.5.2 添加IL-23 特异性中和抗体前后p-m TOR的变化49-50
• 4.5.3 IL-23 通过活化m TOR信号通路抑制甲状腺上皮细胞自噬50-52
• 4.5.3.1 雷帕霉素作用浓度及时间50-51
• 4.5.3.2 雷帕霉素的加入逆转了IL-23 诱导的甲状腺上皮细胞自噬水平的下降51-52
• 4.6 雷帕霉素下调IL-23 诱导的ROS的累积52-53
• 4.7 桥本氏甲状腺炎患者的甲状腺上皮细胞内AKT/m TOR信号高度活化53-55
• 第五章 讨论55-57
• 第六章 主要结论及展望57-58
• 6.1 主要结论57
• 6.2 展望57-58
• 参考文献58-68
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文与参加的会议68-70
• 致谢70-71

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