白介素-22改善游离脂肪酸诱导的胰岛β细胞内质网应激的机制研究

发布时间：2017-08-08 18:08

  本文关键词：白介素-22改善游离脂肪酸诱导的胰岛β细胞内质网应激的机制研究

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【摘要】：研究背景：糖尿病是一种由遗传、环境和行为等多种致病因素导致的以慢性血糖升高为特征的内分泌代谢性疾病。作为死亡率仅次于肿瘤和心脑血管疾病的第三大慢性非传染性疾病,糖尿病的并发症包括视网膜病变、周围神经病变、糖尿病肾病,而这些不仅增加了社会的经济负担,而且严重影响了人们的生活质量。随着经济的不断发展,人们的体力劳动强度及生活饮食方式发生了明显的变化,加上人口老龄化的问题,我国的糖尿病患病率在近年来迅速增长,从1980年的低于1%,1994年的2.5%,2002年的5.5%,2007年的9.7%,增长至如今的11.6%。据国内最新的流行病学数据,目前我国有约1亿多的成人糖尿病患者,近5亿的糖尿病前期人群,因此,糖尿病已成为我国一个不可忽视的公共卫生问题。在2型糖尿病中,由于β细胞功能衰竭和长期的胰岛素抵抗,机体内的胰岛素需求不断增加,而内质网是胰岛素原的主要加工成熟场所,因此导致β细胞内质网不堪负荷。这一过程加上血液中高水平的脂肪和葡萄糖刺激,激活了细胞在高分泌活动时的重要适应性细胞信号反应,即非折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR),也就是大家熟知的内质网应激,而过度或持久的内质网应激又可干扰β细胞功能,形成一个恶性循环。前期研究表明,胰岛β细胞长期暴露于高脂环境中,细胞会产生过多的活性氧分子,从而导致氧化应激,干扰细胞的新陈代谢,激活免疫系统；另外,氧化应激也可干扰胰岛素在内质网的加工过程,导致胰岛素合成减少,刺激免疫系统,甚至引发p细胞凋亡。因此,在脂毒性的作用下,氧化应激及内质网应激是导致胰岛p细胞凋亡和功能异常的重要因素。而最新的研究发现,当将一种特定的细胞因子——白介素-22(interleukin-22, IL-22)喂给肥胖与糖尿病小鼠时,可保护p细胞免于负荷并完全恢复对血糖的控制,结果显示此作用是通过减轻p细胞内的氧化应激及内质网应激而达成的。IL-22,属于IL-10细胞因子家族,其受体广泛分布在皮肤、肝脏、肾脏以及某些呼吸道和胃肠道系统的组织细胞,其具体效应却因为组织特异性或其他炎性因子环境的差异而截然不同。早在2008年,研究发现IL-22受体在胰岛中包括p细胞中丰富表达,提示IL-22具有影响p细胞的功能及命运的能力。随着研究的深入,人们不仅发现IL-22可促进胰岛p细胞的增殖和减轻糖尿病足的炎症反应,而且逐步揭示了IL-22的作用受自噬途径所调节。众所周知,自噬对于维持p细胞的结构、数量和功能等具有重要作用,而有研究表明自噬可能通过减轻内质网应激实现对p细胞的保护作用。由此,我们猜测,IL-22可减轻高脂引起的氧化应激和内质网应激,其机制可能与激活自噬途径有关。本研究以大鼠INS-1胰岛μ细胞为研究对象,从细胞水平研究游离脂肪酸是否引起INS-1胰岛p细胞的氧化应激和内质网应激及IL-22对其是否有保护作用,进一步明确IL-22是否通过激活自噬途径拮抗游离脂肪酸引起的氧化应激和内质网应激,从而为糖尿病的发病机制和防治策略提供新的理论依据和思维视角。第一部分游离脂肪酸对INS-1胰岛p细胞内质网的影响及白介素-22对其的作用目的：本部分实验以体外培养的大鼠INS-1胰岛p细胞为研究对象,观察游离脂肪酸对大鼠胰岛p细胞的内质网有何影响,及IL-22对高脂影响下的胰岛p细胞是否有保护作用。方法；1.实验分组探讨不同浓度棕榈酸(palmitate acid, PA)对INS-1细胞氧化应激的影响时按以下分组：空白对照组、BSA对照组、0.1mM PA组、0.25mM PA组、0.5mMPA组、0.75mM PA组,分别作用细胞24h;探讨PA作用不同时间对INS-1细胞氧化应激的影响时按以下分组：空白对照组、6h组、12h组、24h组、36h组、48h组,以0.5mM PA作用细胞；探讨PA对INS-1细胞内质网应激的影响时按以下分组：空白对照组、0.5mM PA组、NAC组,分别作用细胞24h；探讨IL-22对PA作用下的INS-1细胞内质网应激的影响时按以下分组：空白对照组、0.5mMPA组、0.5mM PA+50ng/ml IL-22组,分别作用细胞24h。2.INS-1细胞培养复苏大鼠INS-1胰岛p细胞后,用含10%胎牛血清、50μmmol/L β-巯基乙醇、10mmol/L HEPES试剂、1mmol/L丙酮酸钠,100mg/L链霉素和1×10SIU/L青霉素的RPMI-1640完全培养基,置于37℃、5%CO2孵箱中培养细胞。2-3天换液或传代一次。3. DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧将INS-1细胞接种在六孔板中,同步化处理后按实验分组进行干预。培养结束后,各组中分别加入终浓度为10μM的DCFH-DA,37℃、5%孵箱内避光孵育20-30min后,用PBS洗涤细胞三次。加入0.5mL的无血清RPMI-1640培养基并在荧光倒置显微镜下观察拍照。随后用胰酶消化并收集细胞,用流式细胞仪检测各组的荧光强度,由此判断细胞内的活性氧情况。4. Western blot法检测细胞GRP78及CHOP蛋白的表达水平INS-1细胞培养在六孔板中,同步化处理后按各组处理因素(空白对照组、0.5mM PA组、0.5mM PA及500μmol/ml NAC联合处理组)。收集各组细胞后,提取细胞总蛋白,随后用BCA法测定其蛋白浓度。当SDS-PAGE电泳结束后即可进行转膜,并室温封闭2h。洗膜三次后加入兔抗鼠GRP78、CHOP及GAPDH多克隆抗体室温孵育2h,然后洗膜三次,用HRP标记的二抗室温振荡孵育2h。洗膜三次后,用ECL发光液1ml孵育5分钟,显影、定影并扫描为图像。图像用Quantity One图像分析软件进行灰度分析。统计学处理：用SPSS20.0统计软件进行统计学分析,计量数据以均数±标准差(x±S)表示,方差齐时,多样本比较采用单向方差分析(One-Way ANOVA)检验,组间两两比较采用LSD检验；方差不齐时,多样本比较采用校正Welch检验,组间两两比较采用Dunnett T3法。P0.05具有统计学意义。结果：1.PA对INS-1细胞氧化应激的影响1.1不同浓度PA对细胞氧化应激的影响INS-1细胞按实验分组干预24小时后,荧光显微镜下观察0.1、0.25、0.5mM及0.75mM PA组细胞的荧光强度比空白对照及BSA对照组明显增强,而且0.1、0.25mM及0.5mM PA组细胞的荧光强度随PA的浓度升高而增强。用流式细胞仪检测结果显示,0.1、0.25、0.5mM及0.75mM PA作用INS-1细胞24h后,细胞内的ROS含量(DCFH平均荧光强度)分别是183.045±3.169,283.117±3.973,326.479±4.097,164.069±4.174,均显著高于空白对照组(100.000±3.436)和BSA对照组(106.205±3.637)(P=0.000)。而且,0.25mM PA组显著高于O.1mM PA组(P=0.000),0.5mM PA组显著高于0.25mM PA组(P=0.000)及0.1mM PA组(P=0.000)。1.2 PA作用不同时间对INS-1细胞氧化应激的影响0.5mM PA分别作用INS-1细胞6h、12h、24h、36h、48h后,荧光显微镜显示,6h、12h、24h、36h、48h组细胞的荧光强度比空白对照组明显增强,而且6h、12h及24h这三组细胞的荧光强度随时间的延长而增强。用流式细胞仪检测结果显示,0.5mM PA分别作用INS-1细胞6h、12h、24h、36h及48h,细胞内的ROS含量分别为177.168±5.091,245.154±3.095,255.227+2.153,119.409±2.605, 115.237±2.162,均高于空白对照组(100.000±1.521)(P=0.000)。而且,12h组显著高于6h组(P=0.000),24h组显著高于6h组(P=0.000)及12h组(P=0.001)。2.PA通过氧化应激途径对INS-1细胞引起内质网应激在以上PA作用不同浓度、不同时间对INS-1细胞氧化应激的影响实验中,我们得出0.5mM PA干预细胞24小时是最合适的浓度和时间。因此,在后续实验中,我们使用该浓度及时间为合适的干预条件。各组细胞经干预24h后,PA组的GRP78及CHOP蛋白表达水平分别为2.207±0.085,2.105-0.164,显著高于空白对照组(0.979±0.040,1.088±0.057)(P0.05),而NAC组的GRP78及CHOP蛋白表达水平分别为1.613±0.063,1.788±0.093,显著低于PA组(P0.05)。3.IL-22对PA诱导的INS-1细胞氧化应激及内质网应激的影响3.1 IL-22对PA诱导的INS-1细胞氧化应激的影响INS-1细胞按实验分组干预24小时后,荧光显微镜下观察PA组细胞的荧光强度比空白对照组明显增强,而PA+IL-22组细胞的荧光强度比PA组显著减少。用流式细胞仪检测结果显示,PA组细胞内的ROS含量(DCFH平均荧光强度)是827.265±134.803,显著高于空白对照组(100.000±7.961)(P=0.000)。PA+IL-22组细胞的ROS含量为239.207±148.325,与PA组相比显著降低(P=0.000)。3.2IL-22对PA诱导的INS-1细胞内质网应激的影响各组细胞干预24h后,PA组的GRP78及CHOP蛋白表达水平分别为2.485±0.101,2.270±0.127,显著高于空白对照组(1.083±0.170,1.076±0.164)(P0.05)。PA+IL-22组细胞的GRP78及CHOP蛋白表达水平分别为1.877±0.056,1.489±0.042,与PA组相比显著降低(P0.05)。结论：PA能以剂量及时间依赖性诱导INS-1胰岛μ细胞氧化应激增强,并且通过增加细胞内ROS的含量使内质网应激标志蛋白GRP78、CHOP的表达增多；而加入IL-22后,PA引起的INS-1胰岛μ细胞内ROS含量及GRP78、CHOP等表达水平明显减少。本部分实验证明IL-22对PA诱导的INS-1胰岛μ细胞氧化应激及内质网应激有保护作用。第二部分白介素-22对游离脂肪酸诱导INS-1胰岛μ细胞氧化及内质网应激的保护作用的相关机制目的：通过上述实验我们观察到IL-22对PA诱导的INS-1胰岛μ细胞氧化应激及内质网应激有保护作用,本部分实验将进一步明确该保护作用的相关机制,为防治糖尿病提供新的理论依据。方法：1.透射电子显微镜观察细胞内自噬的超微结构实验分组：空白对照组；PA组(含0.5mM PA); PA+IL-22组(含0.5mM PA及50ng/ml IL-22)。将INS-1细胞培育于六孔板中,各孔同步化处理后按实验分组干预细胞24h。丢弃培养液并用PBS溶液洗涤2次后,用细胞刮收集细胞并离心。’沿管壁缓慢加入3%戊二醛溶液于4℃固定2h后,漂洗三次。然后,用丙酮梯度脱水和1%醋酸铀块染2小时,完全浸渗后用环氧树脂包埋。接着将标本超薄切片,并用醋酸铀和枸橼酸铅双重染色。最后,置于透射电子显微镜下观察并摄片。2.细胞免疫荧光检测细胞内LC3B的表达实验分组同上。各孔同步化处理后按实验分组干预细胞24小时后,丢弃细胞培养液并漂洗3次。然后用4%多聚甲醛固定后,用PBS溶液洗涤3次。封闭后,用1%BSA稀释的一抗4℃孵育过夜。漂洗3次后,加入1%BSA稀释的相应二抗于室温孵育1h。漂洗三次后加入5μg/ml DAPI染色2min,并用抗淬灭封片剂封片。最后,利用荧光显微镜观察、拍照。3. Western blot法检测细胞Beclin-1、LC3B、GRP78及CHOP蛋白的表达水平检测Beclin-1及LC3B蛋白的表达水平时实验分为3组：空白对照组；PA组(含0.5mM PA); PA+IL-22组(含0.5mM PA及50ng/ml IL-22)。检测GRP78及CHOP蛋白的表达水平时实验分为4组：空白对照组；PA组(含0.5mM PA); PA+IL-22组(含0.5mM PA及50ng/ml IL-22); PA+IL-22+3-MA组(含0.5mM PA、50ng/ml IL-22及5mM3-MA)。具体方法同第一章。4. DCFH-DA荧光探针检测细胞内活性氧实验分组：空白对照组；PA组(含0.5mM PA); PA+IL-22组(含0.5mM PA及50ng/ml IL-22); PA+IL-22+3-MA组(含0.5mM PA、50ng/ml IL-22及5mM 3-MA).具体方法同第一章。统计学处理：同第一章。结果：1.IL-22可诱导PA作用下的INS-1细胞的自噬发生1.1透射电子显微镜观察细胞内自噬的超微结构各组细胞干预24h,利用透射电子显微镜可见,在空白对照组,细胞内线粒体和内质网等细胞器结构正常,胞质中未发现空泡化改变,仅可见少量自噬；在PA组(含0.5mM PA)可见自噬相关结构增多,线粒体及内质网等细胞器较空白对照组肿胀,且胞质出现轻微空泡化改变：在PA+IL-22组(含0.5mM PA及50ng/ml IL-22)中,胞质出现空泡化改变,并出现大量包含细胞内容物及细胞器的自噬相关结构。1.2荧光显微镜观察细胞内LC3B蛋白的表达水平用细胞免疫荧光法观察INS-1细胞质内LC3B的表达情况：LC3B为绿色荧光,细胞核为蓝色。各组细胞干预24h后,利用荧光显微镜,可见PA+IL-22组细胞内LC3B的表达显著高于空白对照组及PA组。1.3 IL-22上调PA作用下的INS-1细胞内Beclin-1及LC3B蛋白的表达水平各组细胞干预24h后, western blot结果显示：PA+IL-22组的Beclin-1及LC3B蛋白表达水平分别为2.177±0.166,1.464±0.105,显著高于空白对照组(0.629±0.065,0.118±0.004)及PA组(1.071±0.084,0.773±0.091)(P0.05)。2.IL-22通过自噬途径减轻PA诱导的INS-1细胞氧化应激及内质网应激2.1 IL-22通过自噬途径减轻PA诱导的INS-1细胞的氧化应激INS-1细胞按实验分组干预24小时后,荧光显微镜下观察PA组细胞的荧光强度比空白对照组明显增强,而PA+IL-22组细胞的荧光强度比PA组显著减少。然而,在PA+IL-22+3-MA组,IL-22的上述作用可被逆转,该组细胞的荧光强度比PA+IL-22组显著增强。用流式细胞仪检测结果显示,PA组细胞内的ROS含量(DCFH平均荧光强度)是370.467±25.461,显著高于空白对照组(100.000±3.657)(P=0.000)。PA+IL-22组细胞的ROS含量为164.377±16.999,与PA组相比显著降低(P=0.000)。然而,加入自噬阻断剂3-MA后,IL-22的上述作用可被逆转,PA+IL-22+3-MA组细胞的ROS含量为283.853±8.530,比PA+IL-22组显著增加(P=0.000)。2.2 IL-22通过自噬途径减轻PA诱导的INS-1细胞的内质网应激INS-1细胞按实验分组干预24h后,western blot结果显示：PA组的GRP78及CHOP蛋白表达水平分别为2.520±0.027,2.546±0.054,显著高于空白对照组(1.136±0.013,1.115±0.019) (P0.05)。PA+IL-22组细胞的GRP78及CHOP蛋白表达水平分别为1.671±0.062,1.529±0.015,与PA组相比显著降低(P0.05)。然而,加入自噬阻断剂3-MA后,IL-22的上述作用可被逆转,PA+IL-22+3-MA组细胞的GRP78及CHOP蛋白表达水平分别为2.106±0.081,2.263±0.033,比PA+IL-22组显著增强(P0.05)。结论：IL-22能诱导PA作用下的INS-1胰岛μ细胞自噬的发生,并通过自噬途径减轻PA诱导的INS-1胰岛μ细胞氧化应激及内质网应激。
【关键词】：白介素-22 游离脂肪酸 氧化应激 内质网应激 自噬
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1
【目录】：

• 摘要3-12
• ABSTRACT12-24
• 前言24-32
• 参考文献28-32
• 第一部分 游离脂肪酸对INS-1胰岛B细胞内质网的影响及白介素-22对其的作用32-55
• 1. 材料与试剂33-38
• 2. 方法与步骤38-42
• 3. 结果42-47
• 4. 讨论47-51
• 参考文献51-55
• 第二部分 白介素-22对游离脂肪酸诱导INS-1胰岛B细胞氧化及内质网应激的保护作用的相关机制55-73
• 1. 材料与试剂55-59
• 2. 方法与步骤59-61
• 3. 结果61-67
• 4. 讨论67-70
• 参考文献70-73
• 全文小结73-74
• 英文缩略词表74-75
• 硕士研究生期间发表论文情况75-76
• 致谢76-77

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本文编号：641310