高浓度胰岛素对肾小管上皮细胞白蛋白、葡萄糖重吸收的影响

发布时间：2017-08-12 19:16

  本文关键词：高浓度胰岛素对肾小管上皮细胞白蛋白、葡萄糖重吸收的影响

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【摘要】：目的:糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)为糖尿病特征性微血管并发症之一,但其发病机制复杂,且2型糖尿病肾病病理表现差异很大。传统观点认为其早期病变主要累及肾小球,并将微量白蛋白尿(microalbuminuria,MAU)作为早期临床诊断指标,但越来越多的研究显示糖尿病肾病在肾小球出现明显损伤之前已存在肾小管及间质的结构及功能损伤,临床主要表现为肾小管性蛋白尿及酶尿,甚至有研究在STZ诱导的糖尿病大鼠中观察到早期白蛋白尿源于肾小管损伤导致的重吸收功能受损,而非源自肾小球。此外,肾小管间质损伤与慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)导致的肾小球滤过率(glomerular filtration rate,GFR)下降及肾功能恶化的关系更加密切。因此,肾小管损伤在糖尿病肾病中的发生原因、机制及其结构功能改变应受到重视。我们前期研究发现,78.2%的DM患者在尿微量白蛋白升高前,已出现不同程度的肾小管功能异常,以高脂饲料喂养OLETF大鼠诱导的2型糖尿病模型,在糖耐量减低期(impaired glucose tolerance,IGT)即已出现明显的肾小管上皮细胞及间质微血管的病理损伤,且尿中反映肾小管损伤的指标:尿视黄醇结合蛋白(RBP)、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)和中性粒细胞明胶酶相关载脂蛋白(NGAL)等排泄增加,但肾小球的结构及反映其功能的血液、尿液生化指标未见明显异常。那么在糖尿病前期,导致肾小管结构及功能损伤的原因是什么?胰岛素抵抗/高胰岛素血症是CKD发生的独立危险因素。有研究发现高胰岛素对肾脏的损害在血糖升高前即已开始。IGT期一个重要的病理生理变化就是胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)及在此基础上逐渐出现的代偿性高胰岛素血症。这种代偿升高的胰岛素虽然有助于控制血糖,但过高的胰岛素对肾脏等其它组织却是有害的。那么在血糖尚未明显升高之前,以胰岛素抵抗/高胰岛素血症为主要特征的代谢紊乱是否会影响肾小管的结构及功能,参与糖尿病肾病的发生发展?肾脏在体内糖代谢过程中也发挥重要作用。所有的肾小球细胞和肾小管细胞均存在胰岛素受体。肾脏正常的胰岛素信号通路依赖胰岛素与其细胞膜受体的结合,并激活一系列细胞内的级联反应而发挥效应。因此我们推测,高浓度胰岛素可能通过胰岛素信号通路影响肾小管功能。本研究以大鼠近端肾小管上皮细胞株(NRK-52E)为研究对象,观察在不同胰岛素浓度及不同干预时间作用下,肾小管上皮细胞对白蛋白及葡萄糖重吸收的变化,以及介导白蛋白(megalin,cubilin)及葡萄糖(SGLT2,GLUT2,SGLT1,GLUT1)重吸收的受体表达的变化,同时探讨INS/IRS-1/PI3K/Akt通路在其中的参与作用。方法:1.MTT法检测不同浓度的胰岛素对NRK-52E细胞活力的影响,并结合胰岛素的生理浓度以确定其干预浓度,并进一步分为对照组、胰岛素低浓度组、中等浓度组及高浓度组。2.不同浓度的胰岛素作用于NRK-52E细胞24h后,运用免疫荧光法、荧光定量PCR(Fluorescent quantitative PCR,FQ-PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)技术分别从基因和蛋白水平检测megalin,cubilin,SGLT2,GLUT2,SGLT1及GLUT1受体表达量的变化。3.以高浓度胰岛素干预细胞不同时间(0,1h,6h,12h,24h,48h)后,分别用免疫荧光、荧光定量PCR和Western Blot法检测megalin,cubilin,SGLT2,GLUT2,SGLT1及GLUT1受体表达量的变化。4.应用激光共聚焦显微镜观察NRK-52E细胞吞饮异硫氰酸四甲基罗丹明标记的牛血清白蛋白(TRITC-albumin)的变化。5.应用激光共聚焦显微镜观察NRK-52E细胞吞饮荧光标记2-脱氧葡萄糖(2-NDBG)的变化。6.应用FQ-PCR和Western Blot法检测在不同浓度的胰岛素及不同干预时间作用下,NRK-52E细胞IRS-1、PI3K及Akt的变化。7.设置对照组、PI3K抑制剂组与高浓度胰岛素干预组,应用免疫荧光法观察各组对TRITC-albumin、2-NDBG的重吸收及各受体蛋白的变化趋势并进行比较。结果:1.结合MTT法检测结果,确定胰岛素干预浓度:0 ng/ml(对照组),5 ng/ml(低浓度干预组,相当于生理浓度),10 ng/ml(中等浓度干预组),50ng/ml(高浓度干预组)。2.不同胰岛素浓度干预下,NRK-52E细胞的megalin与cubilin表达量均在低浓度干预组最大(P0.05),以后逐渐减少,至高浓度干预组表达最少。二者在干预时间为0-6h逐渐增加,至6h最大(P0.05),此后逐渐减少,至48h最少。3.NRK-52E细胞对白蛋白的摄取与胰岛素浓度有关,在胰岛素干预浓度为5ng/ml时最大(P0.05),此后随干预浓度的增加,摄取量逐渐减少。4.不同胰岛素浓度干预下,NRK-52E细胞SGLT2与GLUT2的表达呈浓度依赖性增加,GLUT1仅在高浓度胰岛素干预组表达量增加,SGLT1未见明显变化。不同干预时间条件下,各葡萄糖转运体的最高表达量均出现在干预6h(P0.05),此后虽有减少,但仍较对照组高。5.NRK-52E细胞对葡萄糖的吞饮量随胰岛素浓度的增加而增加。6.高浓度胰岛素条件下,肾小管上皮细胞的胰岛素信号通路IRS-1、PI3-K及Akt的活性受到抑制(P0.05)。结论:1.高浓度胰岛素条件下,肾小管上皮细胞胰岛素信号通路IRS-1/PI3-K/Akt受到抑制。2.高浓度胰岛素通过抑制信号通路IRS-1/PI3-K/Akt,下调白蛋白内吞受体megalin、cubilin的表达,导致肾小管上皮细胞对白蛋白的重吸收障碍。3.胰岛素对葡萄糖转运体表达的影响各不相同,高浓度胰岛素可通过上调葡萄糖转运体SGLT2、GLUT2的表达而促进肾小管上皮细胞对葡萄糖的摄取。4.高浓度胰岛素对肾小管上皮细胞葡萄糖重吸收的调控并非通过胰岛素信号通路IRS-1/PI3-K/Akt,其机制有待于进一步研究。
【关键词】：高浓度胰岛素 肾小管 megalin cubilin 葡萄糖转运体
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R692.9
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 缩略语/符号说明13-14
• 前言14-17
• 研究现状、成果14-15
• 研究目的、方法15-17
• 技术路线117-18
• 技术路线218-19
• 一、高浓度胰岛素对NRK-52E细胞白蛋白重吸收的影响19-41
• 1.1 对象和方法19-21
• 1.1.1 研究对象19
• 1.1.2 主要器材19-20
• 1.1.3 主要试剂20-21
• 1.1.4 溶液配制21
• 1.2 实验方法21-27
• 1.2.1 细胞培养21-22
• 1.2.2 MTT检测法检测细胞相对数及相对活力22
• 1.2.3 荧光定量PCR法检测NRK-52E细胞megalin和cubilin表达22-25
• 1.2.4 免疫荧光法检测NRK-52E细胞megalin和cubilin的表达25-26
• 1.2.5 NRK-52E细胞对TRITC-albumin的摄取26-27
• 1.2.6 统计学分析27
• 1.3 实验结果27-37
• 1.3.1 NRK-52E细胞形态27
• 1.3.2 胰岛素干预浓度的确定27-28
• 1.3.3 NRK-52E细胞megalin和cubilin的mRNA表达量28-30
• 1.3.4 NRK-52E细胞megalin的荧光表达量30-32
• 1.3.5 NRK-52E细胞cubilin的荧光表达量32-34
• 1.3.6 胰岛素干预NRK-52E细胞后TRITC-albumin的摄取量34-37
• 1.4 讨论37-40
• 1.4.1 高胰岛素血症与糖尿病肾病37-38
• 1.4.2 糖尿病中肾小管系统的改变38
• 1.4.3 肾脏白蛋白的摄取38-40
• 1.5 小结40-41
• 二、高浓度胰岛素对NRK-52E细胞葡萄糖重吸收的影响41-69
• 2.1 对象和方法42-50
• 2.1.1 研究对象42
• 2.1.2 主要器材42
• 2.1.3 主要试剂42
• 2.1.4 荧光定量PCR法测各葡萄糖转运蛋白表达量变化42-44
• 2.1.5 Western Blot法检测各葡萄糖转运蛋白44-49
• 2.1.6 免疫荧光法检测NRK-52E细胞各葡萄糖转运体表达49-50
• 2.1.7 统计学分析50
• 2.2 实验结果50-63
• 2.2.1 NRK-52E细胞葡萄糖转运体m RNA水平表达量50-53
• 2.2.2 胰岛素不同干预时间下葡萄糖转运体mRNA表达量变化53-56
• 2.2.3 不同胰岛素浓度干预后NRK-52E细胞葡萄糖转运体蛋白水平表达量56-57
• 2.2.4 胰岛素不同干预时间下NRK-52E细胞各葡萄糖转运体蛋白水平表达量57-59
• 2.2.5 免疫荧光法观察不同浓度胰岛素干预后各葡萄糖转运体表达59-62
• 2.2.6 NRK-52E细胞对 2-NDBG的摄取62-63
• 2.3 讨论63-68
• 2.3.1 肾脏的葡萄糖代谢63-65
• 2.3.2 葡萄糖转运体65-66
• 2.3.3 胰岛素与肾脏糖代谢66-68
• 2.4 小结68-69
• 三、高浓度胰岛素对NRK-52E细胞INS/IRS-1/PI3-K/Akt通路的影响69-78
• 3.1 对象和方法69-71
• 3.1.1 研究对象69-70
• 3.1.2 主要器材70
• 3.1.3 主要试剂70
• 3.1.4 荧光定量PCR法测IRS-1、PI3-K变化70-71
• 3.1.5 Western Blot法检测胰岛素信号通路变化71
• 3.1.6 PI3-K抑制剂对NRK-52E细胞受体表达的影响71
• 3.1.7 统计学分析71
• 3.2 实验结果71-76
• 3.2.1 NRK-52E细胞胰岛素信号通路mRNA变化71-72
• 3.2.2 NRK-52E细胞胰岛素信号通路蛋白变化72
• 3.2.3 PI3-K抑制剂对胰岛素信号通路的影响72-73
• 3.2.4 信号通路受抑后NRK-52E细胞受体表达73-76
• 3.3 讨论76-77
• 3.4 小结77-78
• 结论78-79
• 参考文献79-87
• 发表论文和参加科研情况说明87-88
• 综述 胰岛素抵抗/高胰岛素血症导致的肾小管结构及其功能损伤及其机制88-105
• 综述参考文献97-105
• 致谢105-106
• 个人简历106

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本文编号：663186