基质金属蛋白酶在糖皮质激素性骨质疏松症中的作用研究

发布时间：2017-09-05 22:36

  本文关键词：基质金属蛋白酶在糖皮质激素性骨质疏松症中的作用研究

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【摘要】：背景：糖皮质激素(Glucocorticoid, GC可发挥非特异性抗炎、抗毒、抗休克及其免疫抑制等药理学效应,因而被广泛用作炎症、器官移植、自身免疫疾病及肿瘤治疗等领域。但是作为其主要副作用之一的糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid-induced osteoporosis, GIO)的发病率却逐年升高,成为了临床上迫切需要解决的难题。作为最为常见的继发性骨质疏松症,GIO是一种以骨量减少、骨组织微结构破坏、骨密度减低、骨的脆性增加并且骨折风险性升高为特征的代谢性骨病,GIO的发病机制及其防治也越来越受到关注。长期大剂量应用GC后,成骨细胞的增殖受到抑制,成骨细胞和骨细胞的凋亡数量增加,最终导致成骨细胞的骨形成能力下降；GC还可使破骨细胞的生成增多,增加破骨细胞的数目,同时增强其活性,促进破骨细胞性骨吸收,进而导致骨量丢失,造成骨质疏松的发生。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)是一类高度保守的蛋白水解酶,由锌离子依赖性酶组成,可降解基底膜和细胞外基质的大多数蛋白质,从而参与组织再造和器官形成。MMPs通过参与骨改建过程,在骨组织的新陈代谢活动中发挥着极其重要的作用,同时其基因表达、蛋白质合成及表达均受到多种生长因子、细胞因子及激素等因素不同程度的调节。因此,对MMPs的研究可以为骨质疏松的治疗提供一定的理论依据及新的思路。目的：本课题通过检测GIO小鼠骨组织中MMP-2、9、13表达水平的变化及其在体外给予GC后检测骨样细胞中MMP-2、13mRNA的表达变化,探讨MMPs表达异常与GIO的关系,为GIO的预防和治疗方案的选择提供一定的理论依据。方法：第一阶段：本实验选用SPF级7周龄昆明小鼠(20只),随机分为实验组和对照组。在适应性喂养7天后,实验组小鼠经灌胃给予氢化泼尼松(15mg/kg),隔日给药1次；对照组给予等量PBS。2周后行4%多聚甲醛经心脏内灌注固定处死小鼠,取胫骨进行常规固定、脱钙、石蜡包埋、切片,通过HE染色观察组织学改变；进行抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和组织蛋白酶K(CK)的免疫组织化学染色观察破骨细胞数量、分布及活性；采用免疫组织化学方法检测骨组织中SOST、DMP-1、 MMP-2、MMP-9、MMP-13的表达；并对上述结果进行统计学分析。第二阶段：我们通过体外培养小鼠MLO-Y4骨样细胞系,并给予不同浓度(10-6M, 10-7M,10"8M)的地塞米松(Dex)进行干预。采用MTT法检测细胞增殖；采用实时定量荧光逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测骨样细胞中MMP-2、 MMP-13mRNA的表达。结果：第一阶段：1.骨小梁：相比对照组,实验组小鼠①胫骨松质骨区域骨量(BV/TV)明显减少,生长板变薄,皮质骨变窄；②胫骨松质骨中TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶)染色阳性破骨细胞明显增多,且CK免疫组织化学染色提示破骨吸收较为活跃；③胫骨松质骨区域内MMP-2, MMP-9, MMP-13表达明显增多。2.皮质骨：相比对照组,实验组小鼠①胫骨皮质骨中骨细胞数量明显减少；②胫骨皮质骨中骨陷窝不同程度的扩大,并且空陷窝的数量增加;③胫骨皮质骨中出现大小不一的裂隙,在HE染色中呈现与周围正常骨皮质不均一的染色状态；④胫骨皮质骨中DMP-1表达有所减少,SOST表达增多；MMP-2表达明显增加,且主要集中在骨细胞及骨陷窝内表达；MMP-13表达有所增加,并且主要在裂隙中表达；MMP-9表达无明显差异。第二阶段：1.MTT法显示,加入Dex后,MLO-Y4细胞增殖受到抑制,并与给药浓度和时间相关。2. qRT-PCR结果表明,Dex增加了MLO-Y4骨样细胞中MMP-2、-13mRNA的表达水平,并呈剂量、时间依赖效应。结论：应用糖皮质激素后,小鼠胫骨骨小梁中MMP-2、9、13的表达明显增多提示松质骨骨量减少与MMP-2、9、13增多相关。皮质骨中骨细胞发生骨细胞性骨溶解,MMP-2、13表达增多并且多集中在骨细胞及皮质骨裂隙中,提示MMP-2、13与皮质骨早期损害及糖皮质激素性骨质疏松症的发生具有密切的联系。体外培养骨样细胞并给予糖皮质激素后,细胞的增殖受到抑制,MMP-2、13mRNA的表达增多。该研究从体内和体外两个方面论证了GC对骨细胞中MMPs的诱导作用,为糖皮质激素性骨质疏松症提供了新的治疗思路和理论依据。
【关键词】：基质金属蛋白酶 糖皮质激素性骨质疏松症 骨细胞 骨溶解
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R580
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 符号说明12-13
• 前言13-17
• 第一部分 糖皮质激素性骨质疏松小鼠中基质金属蛋白酶的表达17-43
• 1. 材料与方法17-22
• 2. 结果22-32
• 3. 讨论32-37
• 4. 结论37-38
• 参考文献38-43
• 第二部分 糖皮质激素对MLO-Y4骨样细胞中MMPs的影响43-55
• 1. 材料与方法43-48
• 2. 结果48-50
• 3. 讨论50-52
• 4. 结论52-53
• 参考文献53-55
• 全文结论55-56
• 致谢56-57
• 攻读硕士期间发表的学术论文57-58
• 学位论文评阅及答辩情况表58

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本文编号：800616