miR-375通过靶向PDK1抑制胎猪胰腺干细胞的增殖和分化

发布时间：2017-09-15 17:37

  本文关键词：miR-375通过靶向PDK1抑制胎猪胰腺干细胞的增殖和分化

  更多相关文章： 胰腺干细胞(PSCs) miR-375 PDK1 增殖 凋亡 分化

【摘要】：胰腺干细胞(pancreatic stem cells,PSCs)是从胰腺中分离得到的,具有自我更新和多种分化能力的干细胞。在体内外特定条件下能够分化成为胰腺中的多种细胞,包括腺泡细胞、内分泌细胞和胰腺导管细胞,其自我更新和分化受到复杂网络调控,近年来有报道表明miRNA(microRNA)在胰腺发育过程中发挥重要的调节功能,对胰腺的形成以及胰腺内外分泌部功能的发挥都起到重要的调控作用。其中miR-375在胰腺发育到限定性内胚层阶段之前表达量激增并达到峰值,此后表达量降低到β细胞中miR-375低表达。因此,我们认为在多种胰腺细胞中miR-375发挥不同甚至完全相反的功能。本研究我们以miR-375为主线,利用本实验室已分离并建系的胎猪PSCs,经形态学、mRNA及蛋白多层面,采用包括qRT-PCR、流式细胞周期、流式细胞凋亡、Western Blotting、免疫荧光染色等多种检测手段探究了miR-375在PSCs中发挥的作用及机制。通过生物信息学手段预测并利用双荧光素酶报告基因系统验证了miR-375在PSCs中发挥功能的一个重要下游靶基因——PDK1。研究发现,miR-375能够直接靶向PDK1抑制PSCs的增殖、存活和向β样细胞的分化成熟,具体结论包括以下两点:1.miR-375对PSCs的增殖、存活和分化发挥抑制作用合成并转染miR-375的模拟物(miR-375m)、抑制物(miR-375i)和无义物(N.C)过表达和抑制PSCs中的mi R-375。通过BrdU、MTT等检测发现miR-375抑制PSCs增殖。通过qRT-PCR、Western Blotting和流式细胞术检测发现mi R-375能够抑制增殖相关基因的表达并诱导PSCs凋亡。后续我们又采用本实验室已建立的PSCs向胰岛样细胞诱导分化方案,并在诱导过程中转染miR-375m和N.C,对诱导过程中的细胞团进行形态学分析,并对诱导2周后的细胞团进行检测。经过双硫腙染色、qRT-PCR、免疫荧光染色和放射免疫法胰岛素分析,我们发现过表达miR-375能抑制PSCs向胰岛素分泌细胞的分化。2.miR-375通过直接靶向PDK1发挥功能通过生物信息学手段,我们预测了miR-375的下游靶基因,结合关于胰腺发育信号调控的相关报道,我们把研究目标锁定于PDK1。经qRT-PCR和Western Blotting检测发现,mi R-375能够在蛋白水平下调PDK1,但不能改变其mRNA表达量。通过双荧光素酶报告基因系统检测发现,miR-375能够与PDK1靶向结合发挥调控作用。通过Ki67和PDK1的免疫荧光共染实验,我们发现过表达miR-375能够导致Ki67和PDK1阳性细胞数的减少。此后我们检测了PDK1的一个下游原件AKT的磷酸化水平,过表达miR-375能导致AKT磷酸化水平下调,检测结果表明,miR-375靶向PDK1,并通过PDK1-AKT通路调控PSCs。3.PDK1能够促进PSCs增殖和分化用PDK1抑制剂OSU-03012处理细胞,抑制PDK1的功能通过流式细胞术检测发现,OSU-03012会引起PSCs周期阻滞和凋亡的增加。qRT-PCR、免疫荧光染色、Western Blotting检测增殖和凋亡相关基因发现,OSU-03012会引起细胞增殖基因和抗凋亡基因的下调,同时上调凋亡基因的表达。同时我们还在诱导分化体系中添加了OSU-03012,发现分化后的胰岛素样细胞团数减少、体积缩小、结构松散。诱导2w后收集细胞团进行qRT-PCR检测发现,胰岛细胞团分化成熟相关的基因表达下调。这些结果表明,OSU-03012会抑制PSCs的增殖及分化,因此我们推断PDK1能促进PSCs的增殖和分化。
【关键词】：胰腺干细胞(PSCs) miR-375 PDK1 增殖 凋亡 分化
【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1;Q25
【目录】：

• 摘要6-8
• ABSTRACT8-12
• 文献综述12-29
• 第一章 干细胞治疗糖尿病研究进展12-29
• 1.1 糖尿病12-16
• 1.1.1 对糖尿病问题的认识12-13
• 1.1.2 全球糖尿病流行趋势13-16
• 1.1.3 糖尿病及其并发症治疗开支16
• 1.2 干细胞治疗糖尿病研究进展16-22
• 1.2.1 ESCs18
• 1.2.2 iPSCs18-19
• 1.2.3 MSCs19-21
• 1.2.4 PSCs21-22
• 1.3 miR-375研究进展22-29
• 1.3.1 microRNA与胰腺信号调控22-25
• 1.3.2 miR-375在胰腺信号调控中的作用25-29
• 实验研究29-61
• 第二章 miR-375调控PSCs的自我更新和分化29-48
• 2.1 材料29-30
• 2.2 方法30-38
• 2.3 结果38-47
• 2.3.1 miR-375抑制PSCs的增殖38-42
• 2.3.2 miR-375诱导PSCs凋亡42-44
• 2.3.3 miR-375抑制PSCs向胰岛素分泌细胞的分化44-47
• 2.4 讨论47
• 2.5 小结47-48
• 第三章 miR-375通过靶向PDK1调控PSCs功能48-61
• 3.1 材料48-49
• 3.2 方法49-50
• 3.3 结果50-59
• 3.3.1 miR-375下游靶基因筛选50-51
• 3.3.2 miR-375直接靶向PDK1调控PSCs51-55
• 3.3.3 PDK1调控PSCs增殖、凋亡和分化55-59
• 3.4 讨论59-60
• 3.5 小结60-61
• 全文总结61-62
• 本实验的创新点与进一步的研究课题62-63
• 参考文献63-76
• 附录76-79
• 缩略词79-80
• 致谢80-82
• 作者简介82

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本文编号：857960