下丘脑背内侧核神经肽Y表达缺失对大鼠脂肪组织脂代谢的影响研究

发布时间：2017-09-23 11:22

  本文关键词：下丘脑背内侧核神经肽Y表达缺失对大鼠脂肪组织脂代谢的影响研究

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【摘要】：研究背景肥胖及肥胖相关性疾病严重威胁着人类健康,已成为全世界亟待解决的课题。人类和哺乳动物体内,白色脂肪组织(white adipose tissue,WAT)主要司储存能量,棕色脂肪组织(brown adipose tissue,BAT)增强非战栗性产热、增加胰岛素敏感性,改善胰岛素抵抗。成年啮齿类动物体内肩胛间区存在棕色脂肪组织,而腹股沟区、附睾、内脏脂肪组织则为白色脂肪组织。在一定干预条件下,白色脂肪组织可以发生棕色样改变。PR结构域家族的第16个成员PRDM16(PRD1-BF1-RIZ1 homologous domain containing 16)是BAT中高表达的一种转录调节因子,在棕色脂肪细胞分化过程中起正向调节作用,参与诱导细胞线粒体数量增多和功能增强,增强线粒体氧化磷酸化,加速能量消耗和热量生成。Ⅱ型脱碘酶(TypeⅡiodothyronine deiodinase,Dio-2)是棕色脂肪组织的分子标志之一,在棕色脂肪细胞可通过与解偶联蛋白1(uncoupling protein 1,UCP1)的基因特异位点结合启动转录,促进能量代谢。下丘脑在维持能量稳态中发挥重要作用。神经肽Y(neuropeptide Y,NPY)是一种重要的促食欲肽,对摄食的调节多依赖于下丘脑中的NPY神经元,在下丘脑,NPY存在于弓状核、背内侧核等区域,以弓状核含量最丰富。研究显示,特异性敲除高脂饮食诱导的肥胖大鼠下丘脑弓状核NPY基因可改善肥胖大鼠的能量代谢。成纤维细胞生长因子-21(fibroblast growth factor-21,FGF21)可表达于肝脏、脂肪组织和胰腺等器官和组织(啮齿类动物),通过形成FGF21/b-Klotho/FGFR复合体发挥多种生物学效应,改善糖脂代谢。FGF21经交感神经系统诱导WAT中出现米色或棕色脂肪细胞。而下丘脑背内侧核神经肽Y表达缺失与脂肪组织内脂代谢相关基因的表达水平(如PRDM16、Dio-2、FGF21)的关系,尚未见明确报道。目的建立下丘脑背内侧核神经肽Y表达缺失的大鼠动物模型,并给予高脂饮食干预,探讨大鼠的体重改变和脂肪组织脂代谢相关基因PRDM16、Dio-2和FGF21表达变化。实验方法建立动物模型:4-5周龄雄性清洁级SD大鼠80只,其中体重为270-300g的大鼠20只,体重为130-150g的大鼠60只。适应性喂养1周后,构建腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)介导的带有荧光标记的RNAi(RNA interference)重组转运体(AAVsh NPY及AAVsh CTL),病毒滴度为1×109particles/site。其中AAVsh NPY导致表达缺失,AAVsh CTL是作为对照的空载体。用270-300g的大鼠验证建模是否成功,根据Paxinos和Watson大鼠脑图谱定位DMH的位置。随机选取15只分别接受双侧DMH的AAVsh NPY注射,并在注射病毒的1、2和4周后(每周随机选取5只)处死,再随机选取5只分别接受双侧DMH的AAVsh CTL注射,注射4周后处死。处死后迅速取下丘脑,一部分置于液氮中保存,制作冰冻切片观察转染位置,一部分制作石蜡切片应用荧光原位杂交技术检测DMH NPY m RNA的表达,确定病毒重组体能够敲除DMH NPY即建模成功;将余60只大鼠随机均分为两组,根据Paxinos和Watson大鼠脑图谱定位DMH的位置。上述两组分别接受双侧DMH的AAVsh NPY(AAVsh NPY组)及AAVsh CTL空载体(AAVsh CTL组)注射,完成动物模型的建立。每周1次于固定时间对各组大鼠进行称重并记录。实验1~4周所有大鼠给予常规饮食(regular chow,RC),第5周再从AAVsh NPY组及AAVsh CTL组各自随机选取一半大鼠给予高脂饮食(high fat diet,HF),其余大鼠仍给予常规饮食,此时所有大鼠被分为AAVsh NPY HF组、AAVsh NPY RC组、AAVsh CTL HF组、AAVsh CTL RC组。注射病毒16周后处死大鼠,采集腹股沟区和附睾脂肪组织,液氮保存。实时荧光定量PCR(Real time PCR)法测定大鼠腹股沟区和附睾脂肪组织FGF21m RNA、PRDM16m RNA、Dio-2 m RNA的表达。蛋白质印迹法(Western blot,WB)测定大鼠腹股沟区和附睾脂肪组织中PRDM16蛋白表达水平。结果1成功建立下丘脑背内侧核NPY表达缺失的动物模型携带红色荧光的病毒成功注入下丘脑背内侧核,注射后,AAVsh NPY组的NPY m RNA表达水平低于AAVsh CTL组,分别将注射1、2、4周后AAVsh NPY组与AAVsh CTL组比较,均有显著差异(P(27)0.05)。2大鼠体重增加量第5周添加高脂饮食前AAVsh NPY组与AAVsh CTL组比较,有显著差异(P(27)0.05),提示DMH NPY缺失已开始导致体重增速减缓;第16周末:与常规饮食组大鼠相比,高脂饮食组大鼠体重增加显著,差异有统计学意义(P(27)0.01),提示高脂饮食诱导大鼠体重增长迅速;与AAVsh CTL组相比,AAVsh NPY组体重增长量明显较低,有显著差异(P(27)0.01),提示DMH NPY缺失可引起体重增长缓慢。3实时荧光定量PCR结果腹股沟区和附睾脂肪组织FGF21m RNA的表达均呈现以下特征:AAVsh CTL组与AAVsh NPY组比较,差异无统计学意义(P(29)0.05),提示DMH NPY敲除对脂肪组织FGF21表达无影响;与RC组相比,HF组大鼠均呈现低表达,差异有统计学意义(P(27)0.01),提示高脂饮食降低脂肪组织FGF21的表达。各组大鼠附睾脂肪组织中PRDM16和Dio-2 m RNA的表达水平均较低,两者的组间两两比较提示差异无统计学意义(P(29)0.05)。提示DMH NPY表达缺失和高脂饮食对附睾脂肪组织PRDM16、Dio-2 m RNA的表达均无影响。腹股沟区脂肪组织PRDM16和Dio-2 m RNA的表达一致,如下:与AAVsh CTL相比,AAVsh NPY组的表达水平显著升高,差异有统计学意义(P(27)0.01),提示DMH NPY敲除引起PRDM16和Dio-2 m RNA高表达;与RC组相比,HF组表达水平下调,差异有统计学意义(P(27)0.01),提示高脂饮食诱导PRDM16和Dio-2 m RNA表达下降。4 Western blot结果与AAVsh CTL高脂饮食组相比,AAVsh NPY高脂饮食组腹股沟区脂肪组织PRDM16蛋白高表达,差异有统计学意义(P(27)0.01);与AAVsh CTL常规饮食组相比,AAVsh CTL高脂饮食组腹股沟区脂肪组织PRDM16蛋白低表达,差异有统计学意义(P(27)0.01)。而附睾脂肪组织中,组间比较,差异无统计学意义(P(29)0.05)。与RT-PCR检测结果一致。结论1.下丘脑背内侧核神经肽Y表达缺失能上调大鼠腹股沟区脂肪组织棕色脂肪相关基因PRDM16和Dio-2的表达,改善脂代谢,缓解高脂饮食诱导的肥胖。2.高脂饮食可引起大鼠脂肪组织FGF21的表达下调,且敲除下丘脑背内侧核神经肽Y对FGF21的表达无调控作用。
【关键词】：下丘脑背内侧核 成纤维细胞生长因子-21 肥胖症 棕色脂肪组织 神经肽Y
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R589.2
【目录】：

• 摘要4-8
• Abstract8-14
• 中英文缩略词14-16
• 引言16-18
• 材料与方法18-33
• 结果33-40
• 讨论40-44
• 结论44-45
• 参考文献45-47
• 综述 下丘脑背内侧核神经肽Y与肥胖的相关研究进展47-63
• 参考文献59-63
• 个人简介和获奖情况及在校期间发表的论文63-64
• 致谢64

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本文编号：904976