利拉鲁肽对糖尿病合并非酒精脂肪性肝病大鼠自噬与肝细胞脂肪变性作用机制的研究
本文关键词：利拉鲁肽对糖尿病合并非酒精脂肪性肝病大鼠自噬与肝细胞脂肪变性作用机制的研究
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【摘要】：目的:通过观察利拉鲁肽(Liraglutide)干预治疗糖尿病(DM)合并非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)大鼠肝细胞自噬相关标志物LC3ⅡmRNA及蛋白表达的变化,并光镜下观察肝细胞脂肪变性的变化,同时加用氯喹阻断自噬体与溶酶体融合抑制自噬后比较上述指标变化,探讨自噬与肝脏脂质沉积的关系及利拉鲁肽通过调节自噬对肝细胞脂肪变性的影响。方法:1.DM合并NAFLD大鼠模型制备:44只4~5周龄,体重在l80g~200gWistar雄性大鼠,适应性喂养l周,每笼6只。后将大鼠随机分为A、B两组,A组10只,喂以普通饲料13.4kJ/g,其中脂肪提供热量占10.2%,蛋白质占23.3%,碳水化合物占66.5%;B组34只,喂以高糖高脂饲料21.8kJ/g,其中脂肪提供热量占56.0%,蛋白质占7.0%,碳水化合物占37.0%。两组大鼠均自由饮水,每日早晚各投食一次,室温控制在18~22℃,相对湿度30%~70%。12周时剪尾采血,用快速血糖仪测两组大鼠空腹血糖(FBG),A组大鼠FBG 4.4-4.9mmol/L,B组大鼠FBG 5.3-5.9mmol/L。并予B组大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)25mg/kg,A组大鼠注射以等体积的生理盐水,72h后剪尾采血快速血糖仪测FBG≥7.8mmol/L视为糖尿病造模成功,其中A组大鼠血糖均在正常范围,B组大鼠死亡1只,其余均成模。从B组大鼠中随机取8只大鼠处死,取肝组织行HE染色,光镜下观察肝小叶内㧐30%的肝细胞发生脂肪变,并以大泡性脂肪变为主者确定为NAFLD造模成功,8只大鼠均成模。2.实验分组及检测指标:将A组大鼠设为正常糖耐量对照组(NGT组,n=10),将B组大鼠设为实验组,并随机分为三组:DM合并NAFLD组(DM/NAFLD组,n=9);利拉鲁肽干预组(LIR组,n=8),予皮下注射利拉鲁肽,100ug/Kg,Bid;利拉鲁肽+自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)组(LIR+CQ组,n=8),予皮下注射射利拉鲁肽,100ug/kg,bid及氯喹,50mg/kg,每三天一次,共干预4周。后以20%乌拉坦腹腔注射麻醉,开腹,取腹主动脉血,离心,分离血清后放于4℃冰箱保存,待生化方法检测甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl)、丙氨酸氨基转移酶(alt)、天门冬氨酸氨基转移酶(ast),以反应各组大鼠糖脂代谢及肝功能情况。取肝脏组织称取肝湿重,计算肝指数,反应各组大鼠肝脏脂质沉积情况;取内脏脂肪,计算内脏脂肪相对含量(vf/w),反应大鼠腹部脂肪含量;另切取肝组织100mg锡箔纸包好放于冻存管,后投入液氮保存,待pcr法检测自噬相关标志物lc3Ⅱmrna,反应肝细胞自噬变化。在肝右叶距边缘5mm处取1cm×1cm×0.5cm肝组织块浸泡于10%甲醛溶液固定48小时后进行石蜡包埋,备做病理切片,用于免疫组化法检测自噬相关标志物lc3Ⅱ蛋白及光学显微镜下观察肝细胞脂肪变性。3.统计学分析:上述指标均为计量资料,以均数±标准差(`x±s)表示,运用spss13.0统计软件分析,4组实验数据均满足正态分布及方差齐性,4组间两两比较素采用单因素方差分析(anova),lsd检验,p≤0.05为差异有统计学意义。结果:1.各组大鼠一般状况:适应性喂养期间,每只大鼠饮食量、体重无明显差异,精神状态良好,毛色光泽。开始造模期间,b组(高糖高脂喂养)大鼠较a组(普通饲料喂养)大鼠饮食量、体重均增加,b组大鼠体型肥胖、少动。造模成功后,药物干预期间,ngt组大鼠饮食量较之前无变化,体重呈稳定增长,精神状态良好,毛色光泽;dm/nafld组大鼠较同期ngt组大鼠体重增加,少动;lir组大鼠较同期dm/nafld组大鼠饮食量、体重均下降,精神状态良好;lir+cq组大鼠精神萎靡,体毛蓬松失去光泽,有脱毛现象,与同期dm/nafld组大鼠比较,饮食量、体重均下降,与同期lir组大鼠比较,饮食量、体重无差别。2.光镜下各组大鼠肝脏脂质沉积变化及相关指标比较:光境下ngt组大鼠肝组织结构完整、清晰,肝小叶结构正常,胞浆可见极少量小脂滴。dm/nafld组大鼠肝细胞肿大,由多角形变成圆球形,胞质透亮,呈气球样变,胞浆内可见大量大小不一的脂滴,胞核被推向一边。lir组大鼠肝小叶结构清晰,细胞排列整齐,细胞内仅见少量小脂滴。lir+cq组大鼠肝小叶正常结构消失,肝细胞明显增大,胞浆内布满脂滴。与NGT组比较,DM/NAFLD组及LIR+CQ组大鼠肝湿重、肝指数、VF/W、脂肪变性肝细胞数/总肝细胞升高,差异有统计学意义(P0.05),LIR组大鼠差异无统计学意义(P0.05)。与DM/NAFLD组比较,LIR组大鼠肝湿重、肝指数、VF/W、脂肪变性肝细胞数/总肝细胞下降,差异有统计学意义(P0.05),LIR+CQ组肝湿重、肝指数、脂肪变性肝细胞数/总肝细胞升高,差异有统计计学意义(P0.05),VF/W差异无统计学意义(P0.05)。LIR+CQ组较LIR组大鼠肝湿重、肝指数、VF/W、脂肪变性肝细胞数/总肝细胞升高,差异有统计学意义(P0.05)。3.各组大鼠肝细胞自噬相关标志物比较:与NGT组比较,DM/NAFLD组及LIR组大鼠LC3ⅡmRNA及蛋白表达增多,差异有统计学意义(P0.05),LIR+CQ组大鼠LC3ⅡmRNA及蛋白表达下降,差异有统计学意义(P0.05)。与DM/NAFLD组比较,LIR组大鼠LC3ⅡmRNA及蛋白表达升高,差异有统计学意义(P0.05),LIR+CQ组大鼠LC3ⅡmRNA及蛋白表达下降,差异有统计学意义(P0.05)。LIR+CQ组较LIR组大鼠,LC3ⅡmRNA及蛋白表达下降,差异有统计学意义(P0.05)。4.各组大鼠生化指标比较:与NGT组比较,DM/NAFLD组及LIR+CQ组大鼠FBG、TG、TC、LDL、ALT、AST升高,HDL下降,差异有统计学意义(P0.05),LIR组大鼠差异无统计学意义(P0.05)。与DM/NAFLD组比较,LIR组大鼠TG、TC、LDL、ALT、AST下降,HDL升高,差异有统计学意义(P0.05),LIR+CQ组大鼠FBG下降,TG、TC、LDL、ALT升高,HDL下降,差异有统计学意义(P0.05),AST差异无统计学意义(P0.05)。LIR+CQ组较LIR组大鼠FBG、TG、TC、LDL、ALT、AST升高,HDL下降,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1.在DM合并NAFLD早期阶段已存在自噬增强,用利拉鲁肽干预后自噬进一步增强。2.利拉鲁肽能通过增强自噬减少DM合并NAFLD大鼠肝细胞脂肪变性,改善糖脂代谢紊乱及肝功能。
【关键词】：糖尿病 非酒精性 脂肪性肝病 利拉鲁肽 自噬
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.1;R575.5
【目录】：
- 中文摘要5-8
- 英文摘要8-12
- 前言12-14
- 1 材料与方法14-20
- 1.1 主要试剂及仪器14
- 1.2 研究方法14-19
- 1.3 统计学处理19-20
- 2 结果20-27
- 2.1 各组大鼠一般状况20
- 2.2 光镜下各组大鼠肝脏脂质沉积变化及相关指标比较20-23
- 2.3 各组大鼠肝细胞自噬相关标志物比较23-25
- 2.4 各组大鼠生化指标比较25-27
- 3 讨论27-31
- 4 结论31-32
- 参考文献32-35
- 综述35-43
- 参考文献40-43
- 致谢43-44
- 在学期间研究成果44-45
- 个人简历45
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