叉头状转录因子O1对糖尿病肾病小鼠足细胞上皮间质转分化的影响及机制研究

发布时间：2017-10-02 09:37

  本文关键词：叉头状转录因子O1对糖尿病肾病小鼠足细胞上皮间质转分化的影响及机制研究

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【摘要】：背景糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是常见的糖尿病微血管并发症之一,其常见的临床特征为进行性蛋白尿,肾脏足细胞损伤是引起蛋白尿的关键靶点。足细胞位于肾小球毛细血管外的基底膜外层。以往研究表明,足突分离和足细胞凋亡导致蛋白尿,但是,近期有研究发现,蛋白尿发生明显早于足细胞脱落凋亡。Liu等提出,在损伤早期,足细胞可经历上皮间质转分化(epithelia mesenchymal transition,EMT),使足细胞具有运动性,而从基底膜脱落,使滤过屏障受到破坏。Sam认为,足细胞经历EMT为一动态过程,从中阻断其介导通路可逆转足细胞EMT,及时终止足细胞损伤,从而为早期防治蛋白尿的发生,缓解糖尿病肾病进程提供新的方向。叉头状转录因子O1(Forkhead transcription factor O1,FoxO1)在转录翻译、抗氧化应激、糖脂代谢等方面发挥重要作用。本课题组前期研究发现,上调DN大鼠肾皮质FoxO1,可缓解肾小球病变,包括系膜细胞和足细胞损伤。高糖环境下,TGF-β/Smad信号通路激活,介导足细胞发生EMT,表现为上皮细胞标志性蛋白nephrin表达降低,而间质细胞标志蛋白desmin表达升高,肾小球滤过屏障完整性受到破坏,进而出现蛋白尿,促进糖尿病肾病的发展。有研究发现,在肾小管上皮细胞中,TGF-β/Smad/ILK激活促进小管上皮细胞发生EMT。本课题组研究发现,肾小球系膜细胞中上调FoxO1,可抑制TGF-β通路,减少高糖状态下系膜细胞过度合成细胞外基质。然而,在不同细胞中,FoxO1对TGF-β通路的影响因细胞种类而异。因此,本研究推测,在小鼠足细胞中,FoxO1可能通过抑制TGF-β/Smad/ILK信号通路过度激活,减轻高糖诱导的足细胞EMT,从而缓解糖尿病肾病肾脏足细胞损伤。目的研究FoxO1对糖尿病肾病小鼠和高糖下足细胞上皮间质转分化及TGF-β/Smad/ILK传导通路的影响,并对其机制进行探讨。方法使用慢病毒转染的方法,将组成性激活突变型(Constitutively active,CA)FoxO1慢病毒载体(LV-CA-FoxO1)、FoxO1短发夹样RNA慢病毒载体(LV-FoxO1-sh RNA)及空慢病毒载体(LV-NC)转染入足细胞,并使用药物干预TGF-β通路。细胞实验分组为正常糖浓度组(NG组)和单纯高糖(25mmol/L)组(HG组),将转染LV-CA-FoxO1和LV-NC的足细胞培养于高糖(25mmol/L)环境下分为LV-CA-FoxO1组(CA组)和空病毒载体组(NC组),将转染LV-FoxO1-sh RNA的足细胞分为LV-FoxO1-sh RNA组(sh RNA组)和分别使用药物SIS3及QLT0267处理后分为SIS3组和QLT组。各组分别高糖处理72h、药物处理12h后,实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测各组FoxO1、TGF-β1、Smad3、ILK、nephrin、desmin m RNA的表达水平;Western blotting法检测FoxO1、磷酸化FoxO1(p-FoxO1)、TGF-β1、Smad3、磷酸化Smad3(p-Smad3)、ILK、nephrin、desmin的蛋白水平;细胞免疫荧光化学法检测FoxO1的表达及分布,酶联免疫法(Elisa法)检测上清中TGF-β1的分泌量。动物实验部分:通过STZ诱导建立糖尿病小鼠动物模型,使用靶向注射的方法将LV-CA-FoxO1及LV-NC注射入小鼠右侧肾皮质。糖尿病小鼠随机分为3组:糖尿病未治疗组(DM组),LV-CA-FoxO1治疗组(CA组)及LV-NC组(NC组),以正常小鼠作为正常对照组(NG组)。8周末取材,抽取小鼠内眦静脉检测血清肌酐、尿素氮;收集随机尿检测尿微量白蛋白和24小时尿检测24小时尿总蛋白,实时荧光定量PCR检测肾皮质FoxO1、TGF-β1、Smad3、ILK、nephrin、desmin m RNA的表达水平;Western blotting法检测FoxO1、磷酸化FoxO1(p-FoxO1)、TGF-β1、Smad3、磷酸化Smad3(p-Smad3)、ILK、nephrin、desmin的蛋白水平;免疫组化检测肾小球nephrin和desmin表达水平;HE染色及扫描、透射电镜观察肾脏病理学变化情况。结果1.各组FoxO1表达及活性改变:在各组足细胞中,与NG组相比,HG组、NC组FoxO1 m RNA及蛋白表达无明显变化(P0.05),CA组较HG组FoxO1m RNA及蛋白表达升高(P0.05)。HG组较NG组p-FoxO1/FoxO1水平升高(P0.05),转录活性下降;CA组p-FoxO1/FoxO1水平降低(P0.05),与NG组相比,sh RNA组、SIS3组QLT组FoxO1 m RNA及蛋白表达减少(均P0.05),p-FoxO1/FoxO1无变化(P0.05)。在足细胞细胞免疫荧光中NG组、HG组和NC组总红色荧光强度无统计学差异(P0.05),与NG组相比,HG组细胞核中FoxO1红色荧光减弱,胞质中相对增多(均P0.05)。与HG组相比,CA组细胞总红色荧光强度增强,核中与细胞总荧光强度比值增加(均P0.05)。与NG组相比,sh RNA组总红色荧光强度减弱,胞核与细胞总红色荧光强度比值无统计学差异(均P0.05)。2.FoxO1对TGF-β1/Smad3/ILK信号通路的影响:与NG组相比,HG组TGF-β1、Smad3和ILK m RNA及蛋白表达均升高(均P0.05)。与HG组相比,CA组TGF-β1和ILK m RNA及蛋白表达减少,p-Smad3/Smad3升高(均P0.05),而Smad3 m RNA及蛋白表达无差异(P0.05);相比较NG组,sh RNA组中TGF-β1、Smad3和ILK m RNA及蛋白表达均升高,且p-Smad3/Smad3增大(均P0.05)。与sh RNA组相比,SIS3组p-Smad3/Smad3降低,且ILK m RNA及蛋白表达减少(均P0.05),而QLT组仅表现为ILK表达减少(P0.05),通路中其他指标无统计学差异(均P0.05)。3.FoxO1对足细胞上皮标志蛋白nephrin及间质标志蛋白desmin的影响:HG组与NG组相比,nephrin m RNA及蛋白表达降低,desmin m RNA及蛋白表达升高,差异有统计学意义(均P0.05);与HG组相比,CA组nephrin m RNA及蛋白表达升高,desmin m RNA及蛋白表达降低(均P0.05)。与NG组相比,sh RNA组nephrin m RNA及蛋白表达降低,desmin m RNA及蛋白表达升高,差异有统计学意义(均P0.05)。与sh RNA组相比,SIS3组和QLT组nephrin m RNA及蛋白表达升高,desmin m RNA及蛋白表达降低(均P0.05)。NC组与HG组nephrin、desmin m RNA及蛋白表达无统计学差异(均P0.05)。4.各组小鼠肾小球FoxO1表达:在NG、DM和NC组小鼠肾小球中FoxO1m RNA和蛋白无统计学差异(P0.05),CA组中FoxO1 m RNA和蛋白表达增多(P0.05)。与NG组相比,DM组p-FoxO1/FoxO1比值升高(P0.05)。与DM组相比,CA组p-FoxO1/FoxO1比值降低(P0.05)。5.各组小鼠肾小球中FoxO1抑制TGF-β1/Smad3/ILK信号通路的激活:与NG组相比,DM组TGF-β1、Smad3和ILK m RNA和蛋白表达增多,p-Smad3/Smad3比值增大(均P0.05),TGF-β1/Smad3/ILK信号通路激活。与DM组相比,CA治疗组TGF-β1和ILK m RNA和蛋白表达减少(均P0.05),Smad3 m RNA和蛋白表达无变化(P0.05),但是p-Smad/Smad3比值降低(P0.05)。6.FoxO1缓解糖尿病肾病小鼠足细胞EMT:与NG组相比,DM组上皮细胞标志蛋白nephrin m RNA及蛋白表达降低,间质细胞标志蛋白desmin m RNA及蛋白表达升高,差异有统计学意义(均P0.05);与DM组相比,CA治疗组nephrin m RNA及蛋白表达升高,desmin m RNA及蛋白表达降低(均P0.05)。免疫组化结果显示,在糖尿病小鼠肾脏肾小球中,nephrin表达减少,desmin表达增多(均P0.05),而经LV-CA-FoxO1治疗后,nephrin表达增多,desmin表达减少(均P0.05)。7.FoxO1过表达缓解糖尿病小鼠肾脏损伤:与NG组比较,糖尿病未治疗组及LV-CA-FoxO1、LV-NC治疗组血糖水平明显升高。8周末,DM组血清肌酐、尿素氮和尿微量白蛋白、24 h尿蛋白水平较NG组明显升高(均P0.05),CA治疗后血清肌酐、尿素氮和尿微量白蛋白、24 h尿蛋白水平明显降低(均P0.05)。HE染色光镜观察显示NG组小鼠肾小球结构整齐,无明显异常。DM组小鼠肾小球体积明显增大,基底膜异常增厚。透射电镜超微结构显示NG组小鼠肾小球结构清晰,基底膜均匀,无增厚,足细胞胞体饱满,足突排列整齐,DM组大鼠肾小球基底膜明显增厚,且厚薄不均一,足细胞胞体足突融合、缺失。结论1.高糖下足细胞FoxO1转录活性降低,导致足细胞发生上皮间质转分化。2.过表达FoxO1可抑制高糖诱导的足细胞上皮间质转分化,改善足细胞功能紊乱,其机制可能与抑制TGF-β1/Smad3/ILK通路过度激活有关。3.糖尿病肾病小鼠足细胞可发生上皮间质转分化,可能与FoxO1转录活性降低有关。肾脏过表达FoxO1可缓解足细胞上皮间质转分化,减轻蛋白尿,延缓糖尿病肾病的发展。
【关键词】：叉头状转录因子O1 糖尿病肾病 足细胞 上皮间质转分化 转化生长因子β1 Smad3蛋白家族 整合素激酶
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R587.2;R692.9
【目录】：

• 摘要4-9
• Abstract9-16
• 中英文缩略词16-18
• 前言18-21
• 1 材料与方法21-33
• 2 结果33-37
• 3 讨论37-40
• 4 结论40-41
• 附图41-47
• 参考文献47-50
• 综述 足细胞损伤与糖尿病肾病的研究进展50-70
• 参考文献62-70
• 个人简历70-71
• 在学期间发表的学术论文与研究成果71-72
• 致谢72-73

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本文编号：958924