尿酸酶基因工程菌的构建与分泌表达

发布时间：2017-10-05 04:36

  本文关键词：尿酸酶基因工程菌的构建与分泌表达

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【摘要】：尿酸是嘌呤分解代谢产物,部分动物将尿酸通过尿酸酶(Uricase,EC1.7.3.3)的作用转化为水溶性更好的尿囊素排出体外,由于人类在进化过程中尿酸酶基因发生突变,因此,只能以尿酸的形式排出。尿酸排出体外有两种途径,一为通过肾脏排泄(约占排泄量的2/3),但是由于尿酸本身的水溶性有限,增加肾脏尿酸排泄通常易引起肾脏尿酸结石,更加重了对肾功能的损害;一是通过肠道排泄,肠道在排出尿酸中的作用正常情况下虽居于次要地位(约占排泄量的1/3),但是可降低通过肾脏排泄的副作用,主要通过采用蒙脱石吸附、活性炭吸附、肠道透析、进食含高膳食纤维的食物等措施降低肠道尿酸水平,它们或具有降低肠腔尿酸浓度或具有阻止尿酸从肠道吸收入血,增加尿酸从粪便的排出进而具有降血尿酸的效果,但是这几个方法有局限性,不适合长期治疗应用。本实验拟构建尿酸酶基因工程菌,使尿酸酶持续表达并分泌到胞外,促使肠道尿酸转化为尿囊素,不仅可阻止肠道尿酸吸收入血,也可加速血尿酸向肠道的扩散,进而达到降低血尿酸的作用,为探索高尿酸血症新的治疗手段提供依据。1.构建重组原核表达载体pET-28a-sUOX以产朊假丝酵母菌(中国普通微生物菌种保藏管理中心,CGMCC2.120)基因组DNA为模板,PCR扩增尿酸酶编码基因,同时,以金黄色葡萄球菌(ATCC6538)基因组DNA为模板,PCR扩增金黄色葡萄球菌蛋白A(Staphylococcal protein a,SPA)信号肽编码基因。重新改造原核表达载体pET-28a,利用PCR技术删除Lac O和LacI序列,便于不需诱导剂的作用表达尿酸酶,同时便于转化至DH5α中。将尿酸酶编码基因和SPA信号肽编码基因通过DNA连接实验连接后克隆至pET-28a载体中,命名为pET-28a-sUOX,进行测序。测序结果与GenBank查询结果一致。2.尿酸酶的表达将测序正确的重组表达载体pET-28a-sUOX转化到DH5α中,不需诱导剂的作用进行目的蛋白表达。分别收集6h、9h、12h、15h、18h菌体离心收集上清液,经硫酸铵沉淀,透析后经镍层析柱分离纯化得到蛋白产朊假丝酵母菌尿酸酶。随后测定其生物学活性同时用Bradford检测法测定蛋白质含量。其活性为2.99U/mg.
【关键词】：尿酸酶 大肠埃希菌 分泌 持续表达
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R589.7
【目录】：

• 符号说明4-6
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-14
• 参考文献12-14
• 第一部分 构建尿酸酶基因工程菌14-27
• 1 材料与方法14-23
• 2 结果23-24
• 3 讨论24-25
• 参考文献25-27
• 第二部分 尿酸酶的表达27-33
• 1 材料与方法27-30
• 2 结果30
• 3 讨论30-31
• 参考文献31-33
• 全文总结33-34
• 文献综述34-40
• 参考文献37-40
• 致谢40-41
• 硕士期间发表的论文41

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前3条

1 王晓春;李海涛;;高血压前期患者血尿酸水平与颈动脉粥样硬化的关系[J];山东医药;2011年16期

2 罗耀玲;王勇;黄雪萍;冉丹霞;马永平;宋方洲;;大肠埃希菌热不稳定肠毒素B亚单位在婴儿双歧杆菌中的表达[J];中国微生态学杂志;2008年02期

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本文编号：974847