降钙素基因相关肽（CGRP）对人血管内皮细胞活化及分泌趋化因子调节作用的研究

发布时间：2017-10-15 11:16

  本文关键词：降钙素基因相关肽（CGRP）对人血管内皮细胞活化及分泌趋化因子调节作用的研究

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【摘要】：目的银屑病是一种发病率较高的慢性炎症性、自身免疫性皮肤病,其发病机制尚不明确,而神经精神因素作为一个重要的诱发因素在银屑病的发生与发展中起着至关重要的作用。目前研究表明,在与皮肤有关的神经递质中,降钙素基因相关肽(CGRP)是与皮肤免疫细胞联系较密切的神经肽。本课题通过研究CGRP刺激内皮细胞活化并分泌相关趋化因子的影响以及可能的调节信号通路,进一步揭示神经免疫调节异常在银屑病发病机制中的作用。材料及方法1、留取新鲜的脐带,采用胰酶消化法体外培养脐静脉内皮细胞(HUVEC),经M200培养液培养并传至3-4代后,应用不同浓度的CGRP(10-7mol/L、10-8mol/L、10-9mo L)刺激内皮细胞,分别于刺激后的第6h、12h及24h以PE标记的CD62E单抗染色活化的内皮细胞,未处理组为阴性对照组,TNF-α刺激内皮细胞为阳性对照组,分别上机进行流式检测并选择活化的最佳浓度及时间点(10-7mol/L,12h)。2、体外培养HUVEC,以10-7mol/L的CGRP刺激内皮细胞12h作为实验刺激组,预先加入MEK1/2拮抗剂作用1h后以10-7mol/L的CGRP刺激内皮细胞12h作为拮抗剂组,未刺激的内皮细胞为对照组,应用实时荧光定量PCR(RQ-PCR)的方法分别检测内皮细胞分泌趋化因子CCL17、CCL22及CX3CL1的m RNA表达水平。3、体外培养HUVEC,以10-7mol/L的CGRP刺激内皮细胞24h后留取上清作为实验刺激组,预先加入MEK1/2拮抗剂作用1h后以10-7mol/L的CGRP刺激内皮细胞24h作为拮抗剂组,未刺激的内皮细胞为对照组,应用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清中趋化因子CCL17及CCL22的蛋白分泌情况。4、体外培养HUVEC,应用10-7mol/L的CGRP刺激内皮细胞24h后,以未刺激的内皮细胞为对照组,提取两组贴壁细胞总蛋白,采用western-blot法检测ERK1/2蛋白的磷酸化水平。结果:1、流式技术检测细胞活化,CGRP刺激组内皮细胞活化百分比及荧光强度均明显升高,与阴性对照组比较差异有统计学意义,最佳活化浓度及时间点为10-7mol/L,12h。2、实时荧光定量PCR检测趋化因子的m RNA表达水平,与对照组比较,刺激组CCL17及CCL22的m RNA水平均有明显升高,差异有统计学意义(P0.05);拮抗剂组CCL17及CCL22的m RNA升高水平较刺激组降低,差异有统计学意义(P0.05);CX3CL1刺激组及拮抗剂组的m RNA水平较对照组升高,但差异无统计学意义(P0.05)。3、ELISA法检测细胞上清液中蛋白分泌水平,与对照组比较,刺激组上清中CCL17及CCL22的蛋白表达水平均有明显升高,差异有统计学意义(P0.05);拮抗剂组CCL17及CCL22的升高水平较刺激组降低,差异有统计学意义(P0.05)。4、Western Blot法检测ERK1/2蛋白磷酸化水平,实验组较对照组升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论:1、CGRP可以有效刺激内皮细胞活化,并且最佳活化的浓度及时间点为10-7mol/L,12h。2、通过m RNA水平及蛋白水平检测,CGRP可以有效刺激内皮细胞活化并分泌趋化因子CCL17及CCL22,而这一刺激作用可以通过拮抗MEK1/2信号通路而减弱。3、CGRP刺激内皮细胞后,活化的内皮细胞中ERK1/2蛋白的磷酸化水平有所升高。
【关键词】：银屑病 CGRP 脐静脉内皮细胞 趋化因子 ERK1/2
【学位授予单位】：首都医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R758.63
【目录】：

• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-11
• 前言11-14
• 第一部分 CGRP对人脐静脉内皮细胞活化作用的研究14-20
• 1、实验材料14-15
• 2、实验方法15-17
• 3、结果17-19
• 4、结论19-20
• 第二部分 CGRP对人脐静脉内皮细胞分泌趋化因子CCL17、CCL22及CX3CL1的作用的研究20-34
• 实验一 CGRP对人脐静脉内皮细胞分泌趋化因子CCL17、CCL22及CX3CL1的mRNA表达的影响20-28
• 1、实验材料及仪器设备20-21
• 2、实验方法21-26
• 3、结果26-27
• 4、结论27-28
• 实验二 CGRP对人脐静脉内皮细胞分泌趋化因子CCL17及CCL22的蛋白表达的影响28-34
• 1、实验材料及仪器设备28-29
• 2、实验方法29-31
• 3、结果31-33
• 4、结论33-34
• 第三部分 CGRP对内皮细胞 ERK1/2调节通路活化的研究34-40
• 1、实验材料34-35
• 2、实验方法35-39
• 3、结果39
• 4、结论39-40
• 附：总技术路线40-41
• 讨论41-47
• 结论47-48
• 参考文献48-55
• 文献综述55-66
• 参考文献62-66
• 英文缩略词一览表66-67
• 攻读学位期间发表文章情况67-68
• 致谢68-69
• 个人简历69

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