利多卡因促进特应性皮炎Treg分化的作用及机制

发布时间：2017-10-15 11:09

  本文关键词：利多卡因促进特应性皮炎Treg分化的作用及机制

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【摘要】：目的:研究利多卡因治疗前后特应性皮炎(Atopic Dermatitis,AD)患者外周血单个核细胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMCs)及小鼠模型皮损处调节性T细胞(Regulatory T cell,Treg)的表达水平,并明确初始化CD4+T细胞向Treg的定向分化过程中利多卡因的调节作用及其信号通路,探索利多卡因治疗AD的相关机制。方法:在体内,抽取20例AD患者利多卡因治疗前后的外周血并分离PBMCs,RT-PCR法检测Treg重要转录因子FoxP3 mRNA的表达水平,并以流式细胞学技术检测患者PBMCs中Treg(CD4+CD25highFoxP3+CD127low)细胞的比例及其他细胞因子IFN-γ,IL-4,IL-17A,IL-17E mRNA水平的表达情况;使用卵清蛋白经皮致敏Balb/C小鼠构建AD模型,以尾静脉注射利多卡因治疗小鼠,流式细胞学技术检测皮损处Treg细胞(CD4+FoxP3+)及脾脏、淋巴结的Treg细胞(CD4+CD25+FoxP3+Helios-)的表达水平,RT-PCR法检测皮损处其他细胞因子IFN-γ,IL-4,IL-17A,IL-17E mRNA的表达水平。在体外,采用磁珠分选法分离小鼠初始化CD4+T细胞,通过IL-2,TGF-β将其定向分化为treg,同时加入不同浓度的利多卡因,流式细胞学技术检测treg细胞比例,使用cck8法测定细胞活性,提取总蛋白行westernblot检测smads/tgf-β及nf-kb信号通路活化水平。结果:在体内,相较于治疗前,利多卡因治疗后ad患者pbmcs中foxp3mrna表达水平和treg细胞比例均明显上升,且与皮损改善程度相一致;检测患者pbmcs中各细胞因子mrna水平的表达,发现ifn-γ,il-4,il-17amrna水平显著性升高,而il-17emrna水平显著性下降。利多卡因治疗后ad小鼠模型皮损严重度评分显著下降,与其在组织病理学上的改变相一致,从动物实验层面证实利多卡因对ad的治疗有效;检测小鼠皮损处各细胞亚群的炎症因子水平,发现较生理盐水治疗组,利多卡因治疗组小鼠皮损处的foxp3,ifn-γmrna及treg细胞水平上均显著上升,il-4、il-17emrna水平明显下降。体外treg诱导分化试验中,研究发现利多卡因在一定浓度下(0.8mmol/l)可明显提高treg细胞比例,且细胞活性未受影响。在利多卡因0.8mmol/l浓度下,其对treg的上调作用与smad3/tgf-β信号通路显著相关,与nf-kb信号通路活化水平无关。结论:利多卡因在体内可上调ad患者pbmcs及小鼠模型皮损中treg细胞的比例和foxp3mrna的表达水平,并调节部分细胞因子(ifn-γ/il-4和il-17a/il-17e)的表达失衡,在体外可促进treg细胞的分化作用,且该调控作用与smad3/tgf-β信号通路显著相关,与nf-kb信号通路无关。
【关键词】：利多卡因 特应性皮炎 调节性T细胞 分化
【学位授予单位】：上海交通大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R758.2
【目录】：

• 摘要5-8
• Abstract8-12
• 英文缩略语12-13
• 中文部分13-65
• 第一部分 绪论13-16
• 第二部分 材料与方法16-37
• 2.1 研究对象16-19
• 2.1.1 人体相关试验16-17
• 2.1.2 动物相关试验17-19
• 2.2 收集方法19-20
• 2.2.1 AD患者样本收集19
• 2.2.2 小鼠样本收集19-20
• 2.3 细胞制备20-22
• 2.3.1 真皮细胞悬液的制备20
• 2.3.2 脾脏单个核细胞悬液的制备20-21
• 2.3.3 细胞冻存与复苏21-22
• 2.4 试剂22-25
• 2.5 主要仪器及耗材25-26
• 2.6 实验方法26-37
• 2.6.1 AD患者PBMCs的分离纯化26
• 2.6.2 RT-PCR检测26-29
• 2.6.3 Western-Blot检测：29-31
• 2.6.4 磁珠分离法分离纯化初始化CD4~+T细胞31-32
• 2.6.5 CCK-8 法检测利多卡因对小鼠CD4~+T细胞的细胞毒性32-33
• 2.6.6 定向诱导初始化CD4~+T细胞分化，并探究不同浓度利多卡因对其的影响33
• 2.6.7 流式细胞染色检测细胞表达水平33-34
• 2.6.8 ELISA法检测血清总IgE水平34-35
• 2.6.9 免疫组织化学染色检测35-36
• 2.6.10统计学分析36-37
• 第三部分 结果37-51
• 3.1 利多卡因静脉封闭治疗AD患者的作用37-41
• 3.1.1 利多卡因可明显改善AD患者皮损严重程度37-38
• 3.1.2 利多卡因治疗后的AD患者PBMCs中的Treg关键转录因子FoxP3 mRNA水平和Treg细胞(CD4~+CD25highFoxP3+CD127low)的比例均明显上升38-39
• 3.1.3 利多卡因对人体PBMCs中其他细胞因子的调节作用39-41
• 3.2 利多卡因治疗卵清蛋白诱导的AD小鼠的作用41-48
• 3.2.1 成功采用卵清蛋白经皮致敏诱导AD小鼠模型41-44
• 3.2.2 利多卡因治疗对皮损中FoxP3 mRNA和皮损、脾脏、淋巴结的Treg的表达水平的影响44-47
• 3.2.3 利多卡因对小鼠其他细胞因子的调节作用47-48
• 3.3 利多卡因治疗特应性皮炎的机制研究48-51
• 3.3.1 利多卡因在一定浓度下可上调初始化T细胞定向诱导为Treg的比例48-49
• 3.3.2 利多卡因对于Treg的上调作用与Smad3 /TGF-β 信号通路显著相关49-51
• 第四部分 讨论51-57
• 4.1 AD患者PBMCs与小鼠皮损处Treg细胞的表达情况51-52
• 4.2 Treg细胞水平与其他细胞因子表达水平的关系52-55
• 4.3 利多卡因促进Treg细胞分化的机制研究55-57
• 第五部分 结论57-58
• 第六部分 参考文献58-61
• 致谢61-63
• 攻读学位期间发表的相关论文63-65
• 英文部分65-117
• Part One Introduction67-71
• Part Two Materials and Methods71-94
• 2.1 Subjects71-74
• 2.1.1 Human Trials71-73
• 2.1.2 Animal Experiments73-74
• 2.2 Sample Collection74-75
• 2.3 Cells75-77
• 2.3.1 Preparation of murine dermal cells suspension75
• 2.3.2 Preparation of murine spleenocytes75-76
• 2.3.3 Freezing and anabiosis of cells76-77
• 2.4 Reagent Preparation of main reagent77-79
• 2.5 Primary instruments and consumable items79-80
• 2.6 Methods80-94
• 2.6.1 Isolation of PBMCs80-81
• 2.6.2 RT-PCR81-84
• 2.6.3 Western-Blot84-87
• 2.6.4 Purification of Naive CD4~+ T cells87-89
• 2.6.5 Analysis of lidocaine cytotoxicity on murine CD4~+ T Cells89-90
• 2.6.6 In vitro Treg cells differentiation90
• 2.6.7 Flow cytometry90-91
• 2.6.8 Serum total Ig E detection91-92
• 2.6.9 Immunohistochemistry92-93
• 2.6.10 Statistical Analysis93-94
• Part Three Results94-108
• 3.1 Effect of lidocaine therapy on AD pateints94-97
• 3.1.1 Lidocaine therapy significantly ameliorated AD patients’ lesional severity94-95
• 3.1.2 Lidocaine therapy enhanced the percentage of Treg cells and promoted Fox P3 m RNAexpression in both AD patients95-96
• 3.1.3 Lidocaine regulated other cytokines in PBMCs of AD patients96-97
• 3.2 Effect of Lidocaine on the murine OVA-sensitized AD models97-105
• 3.2.1 OVA-sensitized murine AD models were successfully established97-100
• 3.2.2 Lidocaine could up-regulate Fox P3 m RNA expression and the proportion of Treg cells indermis of leisional skin but not in spleen and lymoh nodes100-104
• 3.2.3 Modulation of lidocaine on other cytokines in murine models104-105
• 3.3 Mechanism of lidocaine promotion on the differentiation of Treg cells in AD105-108
• 3.3.1 Lidocaine could up-regulated the proportion of Treg at the concentration of 0.8mmol/L105-106
• 3.3.2 The up-regulation of Treg cells by lidocaine was significantly relevant with Smad3/TGF-βsignaling pathway106-108
• Part Four Discussion108-114
• 4.1 Treg expression in PBMCs of AD patients and murine lesional skins108-110
• 4.2 The relationship between Treg cells and other cytokines110-113
• 4.3 The mechanism of lidocaine promotion on the differentiation of Treg cells113-114
• Part Five Conclusion114-115
• Part Six References115-117

【共引文献】

中国博士学位论文全文数据库 前1条

1 孙海霞;法呢基硫代水杨酸对哮喘小鼠气道炎症，，气道重塑和Th细胞分化的影响及其机制的初步研究[D];南方医科大学;2013年

中国硕士学位论文全文数据库 前2条

1 戴鲡瑶;水杨酸对皮肤屏障功能的影响及其临床应用的研究[D];大连医科大学;2013年

2 邱盼盼;特应性皮炎患儿外周血转录因子RORγ t与Foxp3表达的研究[D];滨州医学院;2012年

本文编号：1036768