干扰素-γ对黑色素瘤细胞血管生成拟态的影响

发布时间：2017-10-18 04:53

  本文关键词：干扰素-γ对黑色素瘤细胞血管生成拟态的影响

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【摘要】：目的研究干扰素-γ(IFN-γ)在体外对人黑色素瘤细胞系MUM-2B迁移、侵袭和血管生成拟态(VM)形成能力的影响,探讨其可能的分子机制。方法以人黑色素瘤细胞系MUM-2B作为研究对象,分3组进行体外培养:对照组在含有10%FBS的DMEM培养基中培养;实验组分别在含有10%FBS的DMEM培养基中加入10μg/L IFN-γ和100μg/L IFN-γ;第一部分:观察IFN-γ在体外对黑色素瘤细胞VM形成能力的影响1.利用划痕实验观察不同浓度的IFN-γ对MUM-2B细胞迁移能力的影响;2.利用Transwell侵袭实验观察不同浓度的IFN-γ对MUM-2B细胞侵袭能力的影响;3.利用三维培养实验观察不同浓度的IFN-γ对MUM-2B细胞体外形成VM管道能力的影响。第二部分:探讨IFN-γ对黑色素瘤细胞VM影响的分子机制4.利用Western blot检测不同浓度的IFN-γ对MUM-2B细胞STAT1磷酸化的影响;5.利用RT-PCR检测不同浓度的IFN-γ对MUM-2B细胞EMT相关标记物VE-cadherin、Vimentin和E-cadherin在m RNA水平表达的影响;6.利用Western blot检测不同浓度的IFN-γ对MUM-2B细胞EMT相关标记物VE-cadherin、Vimentin和E-cadherin在蛋白水平表达的影响;7.利用Western blot检测不同浓度的IFN-γ对MUM-2B细胞EMT相关调节因子Twist1和Slug在蛋白水平表达的影响;8.利用Western blot检测不同浓度的IFN-γ对MUM-2B细胞VEGF在蛋白水平表达的影响;9.利用明胶酶谱实验检测不同浓度的IFN-γ对MUM-2B细胞基质金属蛋白酶家族成员MMP-2和MMP-9活性的影响。结果1.划痕实验结果显示,IFN-γ处理组的细胞迁移距离均低于对照组,100μg/L IFN-γ处理组的细胞迁移距离低于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P0.05);2.Transwell侵袭实验结果显示,IFN-γ处理组的穿膜细胞数均低于对照组,100μg/L IFN-γ处理组的穿膜细胞数低于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P0.05);3.三维培养结果显示,24 h后,对照组细胞可形成平滑、完整的VM管道样结构;实验组细胞均不能形成VM管道样结构;4.Western blot结果显示,IFN-γ处理组细胞的p-STAT1表达水平均高于对照组,100μg/L IFN-γ处理组细胞的p-STAT1表达水平高于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P0.05);5.RT-PCR结果显示,IFN-γ处理组细胞的VE-cadherin、Vimentin在m RNA水平的表达均低于对照组,100μg/L IFN-γ处理组细胞的VE-cadherin、Vimentin在m RNA水平的表达低于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P0.05);IFN-γ处理组细胞的E-cadherin在水平的m RNA表达均高于对照组,100μg/L IFN-γ处理组细胞的E-cadherinm在水平的m RNA表达高于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P0.05);6.Western blot结果显示,IFN-γ处理组细胞的VE-cadherin、Vimentin在蛋白水平的表达均低于对照组,100μg/L IFN-γ处理组细胞的VE-cadherin、Vimentin在蛋白水平的表达低于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P0.05);IFN-γ处理组细胞的E-cadherin在蛋白水平的表达均高于对照组,100μg/L IFN-γ处理组细胞的E-cadherinm在蛋白水平的表达高于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P0.05);7.Western blot结果显示,IFN-γ处理组细胞的EMT调控因子Twist1和Slug在蛋白水平的表达均低于对照组,100μg/L IFN-γ处理组细胞的Twist1和Slug在蛋白水平的表达低于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P0.05);8.Western Blot结果显示,IFN-γ处理组组细胞的VEGF蛋白表达量均低于对照组,100μg/L IFN-γ处理组细胞的VEGF蛋白表达量低于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P0.05);9.明胶酶谱结果显示,IFN-γ处理组细胞MMP-2和MMP-9的活性均低于对照组,100μg/L IFN-γ处理组细胞MMP-2和MMP-9的活性均低于10μg/L IFN-γ处理组,差异具有统计学意义(P0.05);结论1.划痕实验、Transwell细胞侵袭实验和三维培养实验结果显示,加入不同浓度的IFN-γ后,MUM-2B细胞的迁移距离缩短、细胞侵袭数量减少,体外管道形成能力减弱,提示IFN-γ可以在体外抑制黑色素瘤细胞的迁移、侵袭和管道形成能力。2.RT-PCR和Western Blot结果显示,IFN-γ可促进MUM-2B细胞STAT1的磷酸化,抑制MUM-2B细胞间充质标记物VE-cadherin、Vimentin的表达,促进上皮标记物E-cadherin的表达,抑制EMT调控因子Twist1和Slug的表达,提示IFN-γ可通过激活STAT1信号通路而抑制EMT过程,进而抑制黑色素瘤细胞的迁移、侵袭和VM的形成。3.Western Blot和明胶酶谱实验结果显示,IFN-γ可抑制MUM-2B细胞VEGF的表达,抑制MMP-2和MMP-9的活性,提示IFN-γ可通过抑制VEGF的表达而抑制黑色素瘤细胞VM的形成,也可通过抑制VEGF而抑制MMP-2和MMP-9的活性,使其不能为VM的形成提供的足够空间基础,从而抑制VM的形成。
【关键词】：黑色素瘤 干扰素γ 重组 上皮间充质转化 血管内皮生长因子类 血管生成拟态
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R739.5
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-13
• 缩略语13-14
• 前言14-17
• 研究现状、成果14-16
• 研究目的、方法16-17
• 一、IFN-γ 在体外对黑色素瘤细胞VM形成能力的影响17-24
• 1.1 材料与方法17-21
• 1.1.1 实验用细胞系17
• 1.1.2 实验试剂17
• 1.1.3 主要实验仪器17-18
• 1.1.4 实验溶液配制18
• 1.1.5 MUM-2B细胞复苏、培养及传代18-19
• 1.1.6 细胞冻存19
• 1.1.7 细胞计数19
• 1.1.8 实验分组19
• 1.1.9 划痕实验19
• 1.1.10 Transwell侵袭实验19-20
• 1.1.11 三维培养20
• 1.1.12 统计学分析20-21
• 1.2 结果21-24
• 1.2.1 IFN-γ 对MUM-2B细胞迁移能力的影响21-22
• 1.2.2 IFN-γ 对MUM-2B细胞侵袭能力的影响22-23
• 1.2.3 IFN-γ 对MUM-2B细胞体外VM管道形成能力的影响23-24
• 二、IFN-γ 对黑色素瘤细胞VM影响的分子机制24-39
• 2.1 材料与方法24-33
• 2.1.1 实验试剂24-25
• 2.1.2 主要实验仪器25-26
• 2.1.3 实验溶液配制26-28
• 2.1.4 实验分组28
• 2.1.5 Western Blot28-29
• 2.1.6 RT-PCR29-31
• 2.1.7 明胶酶谱实验31-32
• 2.1.8 统计学分析32-33
• 2.2 结果33-39
• 2.2.1 IFN-γ 对MUM-2B细胞STAT1磷酸化的影响33
• 2.2.2 IFN-γ 对MUM-2B细胞EMT标记物mRNA水平的影响33-34
• 2.2.3 IFN-γ 对MUM-2B细胞EMT标记物蛋白表达水平的影响34-35
• 2.2.4 IFN-γ 对MUM-2B细胞EMT调控因子在蛋白水平表达的影响35-36
• 2.2.5 IFN-γ 对MUM-2B细胞VEGF蛋白表达水平的影响36-37
• 2.2.6 IFN-γ 对MUM-2B细胞MMP-2 和MMP-9 活性表达水平的影响37-39
• 讨论39-45
• 结论45-46
• 参考文献46-52
• 发表论文和参加科研情况说明52-53
• 综述 肿瘤细胞血管生成拟态相关分子通路的研究进展53-70
• 综述参考文献62-70
• 致谢70

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本文编号：1053059