慢病毒介导shRNA沉默NCT基因的人永生化角质细胞模型的构建

发布时间：2017-10-23 14:11

  本文关键词：慢病毒介导shRNA沉默NCT基因的人永生化角质细胞模型的构建

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【摘要】：背景：反常性痤疮(AI)又称化脓性汗腺炎,是一种慢性复发性炎症性疾病。2010年,Wang等首先发现编码γ-分泌酶不同亚单位的基因突变可引起家族性AI的发生。至今已报道在AI患者的γ-分泌酶不同亚单位的基因上存在超过20个不同的突变位点,其中多数发生在NCT基因上,且均为功能缺失性突变。而NCT基因表达缺失在反常性痤疮的发病机制中的作用还不明确,需要我们进一步研究。目的：构建NCT基因的RNA干扰慢病毒表达载体并在人永生化角质细胞(HaCaT细胞)上鉴定其沉默效率,进而提供NCT基因稳定下调的人永生化角质细胞模型,为后续研究NCT基因下调对角质细胞的生物学行为影响及其在反常性痤疮的发病机制中的作用奠定实验基础。方法：1.设计3个靶向NCT基因特异性的短发卡RNA (shRNA)表达序列并连接到慢病毒表达质粒pGLV3/H1/GFP+Puro中,成功构建慢病毒重组表达质粒,并通过测序鉴定。2.将构建的重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞,产生慢病毒颗粒,并测其滴度。3.慢病毒感染HaCaT细胞,将细胞分为空白组(未感染病毒)、阴性对照组(NC组,感染空载病毒LV3-shNC)和干扰组(感染NCT-shRNA1、2、3慢病毒),流式细胞仪检测慢病毒转染效率,RT-PCR检测靶基因的沉默效率,并筛选出沉默效果最佳的干扰序列。结果：1.测序验证NCT-shRNA慢病毒重组表达质粒构建成功。2.重组表达质粒与包装质粒共转染293T细胞后生产的慢病毒颗粒滴度为109TU/ml。3.慢病毒感染HaCaT细胞后,流式细胞仪检测慢病毒转染效率大于95%。与NC组相比,干扰组NCT mRNA表达量明显下降,其中NCT-shRNA1组NCT基因沉默效果最佳,干扰效率达到75%。结论：1.成功地构建了NCT-shRNA慢病毒重组表达载体。2.成功地筛选出高效NCT-shRNA干扰序列,并构建了NCT基因稳定下调的人永生化角质细胞模型。
【关键词】：反常性痤疮 NCT基因 RNA干扰 慢病毒载体 HaCaT细胞
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R758.74
【目录】：

• 英文缩略语5-6
• 中文摘要6-7
• 英文摘要7-9
• 前言9-10
• 第一部分 NCT基因的RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定10-22
• 材料与仪器10-11
• 实验方法11-16
• 实验结果16-22
• 第二部分 慢病毒载体介导的NCT基因沉默在HaCaT细胞中表达22-32
• 材料与仪器22-23
• 实验方法23-26
• 实验结果26-32
• 讨论32-35
• 结论35-36
• 参考文献36-38
• 综述38-46
• 个人简历46-48
• 致谢48-50

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1 毛秋霞;慢病毒介导shRNA沉默NCT基因的人永生化角质细胞模型的构建[D];北京协和医学院;2016年

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本文编号：1083781