黑色素瘤恶性增殖分子标记的细胞功能和分子机制研究

发布时间：2017-11-08 01:25

  本文关键词：黑色素瘤恶性增殖分子标记的细胞功能和分子机制研究

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【摘要】：目的:黑色素瘤(Melanoma)是一种源于皮肤、黏膜、眼和中枢神经系统色素沉着区域的黑素细胞恶性肿瘤,其恶性程度高,预后极差。常规的治疗方法(包括手术治疗、放射治疗、化学治疗、免疫治疗等)虽然在一定程度上抑制了肿瘤的发生和发展,但均存在较大的治疗弊端。例如,放射治疗和化学治疗会不可避免的引起严重的副反应,且大多数患者在不到一年内就会产生耐药性。因此,目前亟需找到新的针对黑色素瘤的治疗靶点,以建立个性化的治疗方案,提高患者生存率,延长生存期。针对如何寻找影响黑色素瘤恶性增殖的功能基因,高通量(high-throughput)和高内涵(high-content)的细胞筛选技术显示出较大的应用潜力,发挥着越来越重要的作用。通过在体外或体内的肿瘤细胞中将目的基因过表达或抑制其基因表达,分析由基因表达水平上调/下调产生的信号传导通路和/或细胞功能表型改变,可初步了解基因的生物学功能。继而可以通过体内实验以及临床样本的检测,进一步了解基因的功能以及与疾病发生发展的相关性。方法:在本课题中,我们首先利用人类基因组寡核苷酸芯片,对3例恶性黑色素瘤新鲜组织和3例正常皮肤新鲜组织的全基因组表达谱进行了比较,针对获得的在黑色素瘤组织中表达上升的基因,选择20个在肿瘤组织和正常组织差异倍数(fold change)大于5倍的分子,采用实时荧光定量PCR(q PCR)二次验证其表达水平。结合文献筛选与黑色素瘤相关的基因,作为候选基因深入考察其与发病机制的关系。先使用慢病毒介导的RNAi技术,获得目的基因敲除稳定的黑色素瘤细胞株。接着利用MTT法和克隆形成测定法等验证目的基因敲除对黑色素瘤增殖情况的影响。随后通过对细胞周期的分析和细胞周期相关蛋白和细胞凋亡相关蛋白的检测,探讨目的基因在细胞分裂增殖过程中所发挥的作用和影响细胞增殖的分子机制。最后针对其中一个分子,通过免疫组化方法,检测其在58例黑素瘤组织和49例正常皮肤对照组织的表达差异,分析该分子阳性表达与黑色素瘤临床因素(性别、年龄、转移等)的相关性。结果:1.针对黑色素瘤组织和正常皮肤新鲜组织进行的基因表达谱筛选获得了55个在肿瘤组织中的表达较正常组织的表达水平大于5倍基因,选择差异倍数较大的前20个候选基因,q PCR验证其中有15个基因的表达情况均与芯片结果一致,即在黑色素瘤新鲜组织中,与正常新鲜组织比较,这些基因的表达水平均显著上调(P0.05)。其中真核翻译起始因子3D(eukaryotic translation initiation factor 3,subunit DEIF3D)、肌球蛋白V I(Myosin VI MYO6)和天冬酰胺合成酶(Asparagine Synthetase ASNS)的表达水平也显著上调。2.将表达EIF3D、MYO6和ASNSsh RNA的慢病毒分别感染黑色素瘤细胞株(A431和A375),感染3天后,发现细胞内绿色荧光蛋白(GFP)的表达量达90%以上。与对照组相比,感染了慢病毒介导的特异性敲减EIF3D、MYO6和ASNS基因的sh RNA后,EIF3D、MYO6和ASNS的m RNA和蛋白水平均显著降低(p0.05)。与对照组相比,EIF3D、MYO6和ASNS敲除组在慢病毒感染3天并继续培养后,A431和A375细胞的增殖能力下降了75%以上(p0.05)。平板克隆形成实验结果显示,EIF3D、MYO6和ASNS敲除组单个6孔板内克隆形成的数量降低了80%以上(p0.05),且单个集落中的黑色素瘤细胞数也显著降低。PI染色实验结果显示,EIF3D通过调节A375细胞周期相关分子的表达参与G2/M期调控,而MYO6、ASNS参与G0/G1期调控。Western blot结果显示,EIF3D敲减的A375细胞中,细胞周期蛋白激酶CDK1、CDK2、CDK4,磷酸化的p53和细胞周期蛋白激酶抑制剂p27的表达水平均显著降低。而细胞周期蛋白Cyclin B1、Cyclin D1和细胞凋亡相关的PARP的表达均没有发生显著变化。3.免疫组化的结果表明,EIF3D在黑色素瘤组织中的阳性表达率为100%,显著高于在正常组织中的表达水平,但与患者的性别和年龄等临床因素无关。以上结果提示,EIF3D、MYO6、ASNS三个分子尤其是EIF3D在黑色素瘤的发展过程中发挥重要作用,它们可能是治疗黑色素瘤的潜在有效治疗靶点。结论:与黑色素瘤恶性增殖有关的分子-EIF3D、MYO6和ASNS,在黑色素瘤组织中特异性高表达;慢病毒介导的sh RNA工具能够在体外安全有效地抑制黑色素瘤细胞中EIF3D、MYO6和ASNS基因的表达,继而显著抑制细胞的增殖能力。EIF3D、MYO6和ASNS基因有望作为基因治疗的分子靶标用于黑色素瘤的临床诊断和靶向治疗。后续还应该通过裸鼠成瘤等动物模型,进一步验证基于EIF3D、MYO6和ASNS基因沉默的慢病毒工具是否是黑色素瘤潜在的临床非手术治疗方式。以其中一个分子EIF3D为例,深入研究了其分子机制,发现EIF3D通过调节细胞周期相关蛋白,在细胞水平调节黑色素瘤恶性增殖的表型。但其具体的分子机制还有待于进一步研究。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.5

【参考文献】

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1 李本尚;何映谊;罗长缨;江华;沈树红;蒋黎敏;张蓓;顾龙君;;人白血病细胞株对L-门冬酰胺酶敏感性与门冬酰胺合成酶表达水平的相关性[J];中国实验血液学杂志;2010年03期

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本文编号：1154997