BMP2在雌激素变化参与的皮肤衰老过程中的作用机制研究

发布时间：2017-11-19 11:16

  本文关键词：BMP2在雌激素变化参与的皮肤衰老过程中的作用机制研究

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【摘要】：第一部分BMP-2在雌激素抗去势大鼠皮肤衰老中的作用研究 目的 探讨雌激素水平对皮肤组织的影响,为临床上绝经后妇女皮肤衰老的发病机制及皮肤组织病理学变化提供实验依据。 方法 30只雌性成年Wistar大鼠,随机分为去势组(ovariectomized group,Mod, n=10)、假手术组(sham-operated group,Sham,n=10)、去势+雌激素组(ovariectomized and estrogen injection group,OEI,n=10);去势组切除双侧卵巢,大鼠术前禁水,取6%水合氯醛(0.5mL/100mg)腹腔注射,麻醉后固定四肢,在脊柱两侧第12肋尾侧剪毛,用2%碘酊皮肤消毒,75%酒精脱碘。沿脊柱后正中线外侧1～1.5cm处,以纵形切口依次切开皮肤、分离肌肉、打开壁层腹膜,进入腹膜腔,找到卵巢并切除。假手术组步骤同去势组,但不切除卵巢,只切除卵巢周围小部分脂肪组织。去势+雌激素组：切除大鼠双侧卵巢后,于术后第2天开始皮下注射雌二醇0.05mg/d,持续6天。大鼠饲养6周后腹腔注射水合氯醛后背部净毛,在背部脊柱两侧分别取全层皮肤,主要为真皮成分,共切割2个圆形创面,直径1.8cm,深至皮下,内、外两侧分别做HE染色标本和免疫组化标本。采用放射免疫方法检测了血清雌二醇水平,免疫组化方法检测了皮肤组织BMP-2蛋白的表达；应用光学显微镜对皮肤组织形态和超微结构进行了观察,苦味酸-天狼猩红染色偏振光分析皮肤胶原沉积,分析大鼠皮肤中Ⅰ和Ⅲ胶原的含量以及Ⅰ/Ⅲ胶原的比例,所有数据采用SPSS17.0统计软件进行统计学处理。 结果 1.去势组术后6周后血清雌二醇的浓度显著低于假手术组(P0.05),去势+雌激素组6周后血清雌二醇的浓度显著高于去势组(P0.05)。 2.去势组大鼠喂养6周后皮肤组织各层的细胞萎缩,导管周围的结缔组织纤维增加并出现纤维化,部分腺泡失去正常结构,主要表现为组织结构排列紊乱,细胞体积变小,细胞核没有明显变化,细胞质明显减少,细胞核密集在一起,腺泡呈现出萎缩的状态； 3.苦味酸-天狼猩红法发现去势组术后6周皮肤中Ⅰ和Ⅲ胶原的含量以及Ⅰ/Ⅲ胶原的比例显著低于假手术组(P0.05),去势+雌激素组6周皮肤中Ⅰ和Ⅲ胶原的含量以及Ⅰ/Ⅲ胶原的比例显著高于去势组(P0.05),而假手术组与去势+雌激素组之间无统计学差异(P0.05)。 4.免疫组化法发现去势组6周皮肤组织BMP-2蛋白表达明显高于假手术组(P0.05),去势+雌激素组皮肤组织中BMP-2蛋白水平明显低于去势组(P0.05)。 5.去势组血清雌二醇水平与BMP-2蛋白表达有显著负相关关系(r=-0.9600,P=0.0400)。 结论 去势组大鼠6周后皮肤上皮细胞结构紊乱,呈萎缩状态,功能减退,Ⅰ和Ⅲ胶原的含量以及Ⅰ/Ⅲ胶原的比例明显降低,BMP-2表达上调,增加雌激素对胶原的降解,降低真皮的厚度及弹性,这可能是雌激素水平降低导致皮肤衰老的发病机制。 第二部分雌激素对体外培养的皮肤成纤维细胞BMP-2表达的影响 目的 通过研究雌激素对体外培养的皮肤成纤维细胞BMP-2蛋白的影响,探讨雌激素减缓皮肤老化的机制。 方法 将皮肤标本,用含有抗生素的PBS液清洗皮肤组织的血液和污渍,剪去皮肤组织后,用0.25%胰蛋白酶消化清洁皮肤标本,4℃条件下作用14h,分离表皮和真皮组织,弃去表皮组织后,把其余的真皮组织用含1%胶原酶的37℃的MEM液,在5%二氧化碳培养箱中作用4h,以分离成纤维细胞,收集和洗涤所得的细胞,新分离出的成纤维细胞密度约4x104/mL,加入到含10%胎牛血清的MEM培养基中培养,待成纤维细胞生长成密集单层后,细胞密度约16x104/mE,以1：3的比例进行传代,在孵化箱中培养48h,待细胞贴壁生长的细胞密度约达12x104/mL时,供后续的实验使用。所有细胞都在无血清MEM培养液继续培养24h,然后将将细胞分为4组：第1组为雌激素刺激组：分别向3个培养瓶中加入不同浓度的雌激素(1×10-1mol/L,1×10-2mol/L,1×10-3mol/L);第2组为Noggin拮抗组：分别向3个培养瓶中加入含不同浓度BMP2拮抗剂noggin (Noggin终浓度10,20,30μg/ml);第3组为雌激素刺激+noggin拮抗组：分别向3个培养瓶中加入含不同浓度的雌激素(雌激素终浓度分别为：1×10-1mol/L,1×10-2mol/L,1×10-3mol/L)+含不同浓度Noggin (Noggin终浓度10,20,30μg/mL)第4组为正常对照组：不做任何干预的体外培养皮肤成纤维细胞。取每组体外培养的皮肤成纤维细胞中,采用Western blot检测大鼠成纤维细胞中BMP2蛋白,以及免疫组化法观察大鼠成纤维细胞中BMP2颗粒的多少,从而判断BMP-2蛋白的表达水平。透射电镜观察不同雌激素浓度处理组对于成纤维细胞形态的影响。 结果 体外培养的皮肤成纤维细胞,增殖活跃,形态表现良好,出现典型的梭形和柳叶形,用细胞计数法描绘细胞的生长曲线,结果显示：潜伏期为0至2天,指数生长期为2～5天,然后进入平台期。对成纤维细胞用雌二醇干预,免疫细胞化学的结果显示低剂量组与对照组作比较,两组的BMP-2蛋白表达水平差异无统计学差异,高剂量组的雌激素与对照组相比,高剂量组的雌激素组的BMP-2表达蛋白水平下降,差异有统计学意义(P0.05)。透射电镜下观察到成纤维细胞体积变小,细胞质减少,细胞核形态不规则,核染色质出现浓缩,出现在细胞核膜下的边缘,由于不同的切片的染色质凝集可以采取不同的形式在细胞核不同切面的位置,边界清楚,核膜间隙宽度的变化不等。成纤维细胞超微结构的主要病理显示线粒体肿胀,线粒体嵴结构损伤,显示空泡或云雾状的变化,胞质内可见许多髓样结构。 结论 高浓度的雌激素可以下调成纤维细胞BMP-2蛋白的表达水平,减少BMP-2对胶原的降解,但是低浓度的雌激素没有此作用。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2013
【分类号】：R751

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本文编号：1203362