胸腺素β4对毛囊重建的作用研究

发布时间：2017-11-19 11:33

  本文关键词：胸腺素β4对毛囊重建的作用研究

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【摘要】：研究背景：脱发是困扰许多人的问题,但数十年来其治疗少有突破。目前的脱发治疗药物多是通过减缓毛囊损失或刺激毛发增长来发挥作用,而毛发移植也只是将其他部位的毛囊移到缺损部,尚不能从根本上解决问题。因此,促进毛囊再生才是解决脱发的关键。国内外关于毛囊重建的研究表明,毛囊重建的影响因素主要有表皮和真皮来源的种子细胞及其微环境。目前,采用鼠来源的种子细胞能成功重建毛囊,而大多数文献表明采用人来源的种子细胞尚不能实现毛囊重建。胸腺素β 4是由43个氨基酸残基组成的多肽,最初从胸腺中分离纯化获得,后被发现在体内分布广泛。胸腺素D 4在调节免疫和神经功能方面具有重要作用,也能促进血管生成以及创伤愈合,并促进大小鼠毛发生长。但是关于胸腺素β4对人毛囊重建的作用仍了解甚少。本研究运用胸腺素β4体外刺激人来源的毛囊外根鞘细胞和真皮毛乳头细胞,探讨胸腺素β 4在体外对毛囊重建种子细胞的作用；同时,建立毛囊重建小室模型并应用此模型评价胸腺素β4对鼠毛囊重建的作用。研究目的：1.检测胸腺素β 4对体外培养的人毛囊外根鞘细胞和真皮毛乳头细胞的作用2.构建毛囊重建小室模型3.应用小室模型评价胸腺素β 4对鼠毛囊重建的作用研究方法和结果：1.人毛囊外根鞘细胞和人真皮毛乳头细胞的分离、培养、鉴定方法：取美容术后多余头皮组织,切下含毛乳头的脂肪层,经0.2%的I型胶原酶消化后显微镜下挑选水滴样毛乳头组织并进行贴壁培养；剩余头皮组织切成1-2mm细条,于0.25%中性蛋白酶溶液中浸泡过夜,将头发拔出后于体视显微镜下取毛囊外根鞘中段,胰酶消化后获取人毛囊外根鞘细胞并接种培养。观察外根鞘细胞和毛乳头细胞的细胞形态,并通过免疫荧光染色、流式细胞术以及特殊染色鉴定人毛囊外根鞘细胞和真皮毛乳头细胞。结果：通过显微解剖法获得的人毛囊外根鞘细胞具有较强的增殖能力,接种2-3小时后即可发现有少量细胞贴壁,呈铺路石状,符合典型上皮样细胞特点,7-10天可见细胞融合；免疫荧光染色和流式细胞术结果表明人毛囊外根鞘细胞阳性表达Sox9和CD49f等标志性基因。应用一步酶消化法及水滴状毛乳头组织的镜下挑选获得的真皮毛乳头细胞纯度较高,受真皮成纤维细胞的污染较少,接种2-3天后可见真皮毛乳头细胞从毛乳头组织中迁出,且随着培养时间的延长,真皮毛乳头细胞迁出增多,呈长梭形,碱性磷酸酶染色结果表明该细胞表达毛乳头细胞的标志性基因碱性磷酸酶。2.检测胸腺素β4对体外培乔的人毛囊外根鞘细胞的作用方法：体外培养人毛囊外根鞘细胞的过程中分别向培养基中添加不同浓度的胸腺素β4,终浓度分别为10ng/mL, 100ng/mL和1000ng/mL,经培养24h后观察其形态学改变,获取细胞并提取RNA,应用Real-Time PCR的方法检测胸腺素β 4对人毛囊外根鞘细胞中毛发发育和再生相关基因的表达。结果：人毛囊外根鞘细胞经不同浓度胸腺素β 4处理后,形态学上与未添加药物的对照组未见明显差异；添加不同浓度胸腺素β4处理后的人外根鞘细胞中关于毛囊干细胞标志性基因Sox9、 EPCAM、 TCF3,细胞与微环境相互作用的基因VEGF、 Integrin a 3、Integrin a 5,毛囊再生相关信号通路中如Wnt、EDA等关键基因Lefl、 EDA、 CCN2、 PDGFA、 Follistatin、 Nfatcl的表达,与未添加药物的对照组相比未见统计学差异；各浓度组间未见明显差异。3.检测胸腺素β4对体外培养的人真皮毛乳头细胞的作用方法：体外培养人真皮毛乳头细胞过程中分别向培养基中添加不同浓度的胸腺素β4,终浓度分别为10ng/mL、 100ng/mL、1000ng/mL,经培养24h后观察其形态学改变,获取细胞并提取RNA,应用Real-Time PCR的方法检测胸腺素β4对人真皮毛乳头细胞中毛发发育和再生相关基因的表达,对于有明显改变的基因用Western Blot进行验证。结果：人真皮毛乳头细胞经不同浓度胸腺素β 4处理后,形态学上与未添加药物的对照组相比未见明显差异；添加不同浓度胸腺素β4处理后的人毛乳头细胞中关于真皮毛乳头诱导毛囊再生相关基因ALP、α-SMA、 ACTG2、 TRPSl、 SERPINF1、 PTGER3,细胞与微环境相互作用的基因VEGF、HGF、 Laminin5的表达,与未添加药物的对照组相比未见统计学差异,且各浓度组间也未见明显差异。而纤连蛋白(Fibronectin, FN)在添加胸腺素β4的人毛乳头细胞中的表达较对照组有明显升高,具有统计学意义,Western Blot也进一步验证了FN表达的上调。4.构建毛囊重建小室模型方法：采用直径lcm的聚乙烯瓶内塞作为小室,在裸鼠背部剪一直径约1cm的全层皮肤缺损创面,将小室植入,缝合小室周边皮肤以固定。分离C57BL/6新生小鼠的表皮和真皮细胞,混合后注入小室内。7天后拆除小室并开始观察创口部位的毛囊重建情况。30天后对创口部位皮肤取材并进行HE染色,对其形态结构进行观察。结果：裸鼠创口小室植入部位可见毛囊重建,新生毛发大体观和镜下观与正常无明显差异,且排列极性、生长密度良好。对部分无毛囊重建的创口分析,发现模型构建中小室植入的位置对毛囊再生的成功具有重要的影响。5.应用小室模型评价胸腺素β4对鼠毛囊重建的作用方法：小室模型的建立同上,在重悬细胞时加入不同浓度的胸腺素β4混匀,使其终浓度分别为10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL并连续6天在小室中继续加入不同浓度的胸腺素β4。7天后拆除小室并开始观察创口部位的毛囊重建情况。30天后对创口部位皮肤取材并进行HE染色,对其形态结构进行观察。结果：添加不同浓度胸腺素β4的创口部位的毛囊重建情况与未添加药物的对照组相比无明显差异,各浓度组间也未见明显差异。研究结论：1.胸腺素β4可能通过上调人真皮毛乳头细胞中纤连蛋白的表达而作用于毛囊重建。2.小室模型是一个有效的毛囊重建模型；小室植入位置影响毛囊重建小室模型的构建效果。
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R758.71

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本文编号：1203434