锌指蛋白PRDM5在黑色素瘤细胞增殖和转移中的作用及分子机制

发布时间：2017-11-27 11:05

  本文关键词：锌指蛋白PRDM5在黑色素瘤细胞增殖和转移中的作用及分子机制

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【摘要】：背景恶性黑色素瘤多发于皮肤,转移性很高,是人类皮肤癌中致死率最高的肿瘤,严重威胁人类健康,因此进一步研究黑色素瘤转移的分子机制,寻找新的分子治疗靶点,对于提高黑色素瘤的治疗效率有重要意义。PR区域蛋白家族(PRDI-BF1 and RIZ domain containing,PRDM)属于锌指蛋白家族,是一类组织特异性的转录因子,在细胞分化和恶性转化过程中起重要作用,其家族大多数成员为原癌基因或抑癌基因,与癌症发生有密切关系。PRDM5(又名PFM2)是该家族中新发现的一员,在多种肿瘤组织中呈低表达,与肿瘤细胞凋亡有密切关系,但是其在黑色素瘤中的功能尚缺乏研究。目的1.分析PRDM5对黑色素瘤细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响;2.研究PRDM5促进黑色素瘤转移中的分子机制。方法1.PRDM5对黑色素瘤细胞B16F10增殖能力的影响将构建的PRDM5过表达和基因沉默质粒分别转染至黑色素瘤细胞B16F10细胞,48h后将细胞接种至96孔板,MTT检测PRDM5过表达和基因沉默对细胞增殖的影响。将PRDM5基因沉默质粒共转至黑色素瘤细胞,筛选出稳定转染细胞,大量培养并冻存备用。小鼠皮下注射PRDM5基因沉默稳转细胞,解剖小鼠并称量肿瘤节重量,统计分析PRDM5基因沉默对黑色素瘤细胞体内增殖的影响。2.PRDM5对黑色素瘤细胞B16F10迁移和侵袭能力的影响将prdm5过表达和基因沉默质粒分别转染细胞,48h后换无血清培养基培养过夜,划出痕迹并分别在不同时间测量划痕的宽度,以计算出细胞的迁移能力。使用corning公司的transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力的变化,以nih-3t3细胞的条件培养液作为趋化因子。培养24h后,去除上层的细胞,迁移穿过的细胞通过0.5%结晶紫染色后计数。小鼠尾静脉注射prdm5基因沉默稳转细胞,解剖小鼠,观察其主要内脏器官肿瘤转移情况,计算肺部肿瘤数,研究prdm5基因沉默对细胞在体内转移能力的影响。3.prdm5促进黑色素瘤细胞增殖和转移的分子机制裂解prdm5基因沉默稳转细胞,提取蛋白质,同时将prdm5过表达质粒转染至黑色素瘤细胞,裂解细胞提蛋白,免疫印迹检测细胞裂解液中jnk、erk和wnt信号通路中相关蛋白表达及活性水平,通过加入相应抑制剂和sirna等方法,了解细胞转移过程中有关的分子机制。结果1.prdm5促进黑色素瘤细胞b16f10的增殖通过mtt法间接检测活细胞数量,发现prdm5过表达细胞的数量明显多于转染空载质粒的细胞。小鼠背部皮下注射prdm5基因沉默稳转细胞,2周后比较肿瘤大小并称量,发现来自prdm5基因沉默(siprdm5)稳转细胞的肿瘤,不论是大小还是重量都明显低于sictl稳转细胞引起的肿瘤,说明prdm5对b16f10细胞增殖有促进作用;2.prdm5促进黑色素瘤细胞b16f10的迁移和侵袭细胞划痕愈合实验发现,prdm5过表达细胞划痕最早愈合。细胞迁移和侵袭实验计算穿过小室细胞数量,发现prdm5基因沉默稳转细胞迁移和侵袭能力最弱。这些结果表明prdm5促进黑色素瘤细胞迁移和侵袭;3.prdm5通过mapk/jnk和erk信号通路促进b16f10细胞增殖和转移免疫印迹结果显示,PRDM5过表达时,细胞中JNK蛋白表达及磷酸化水平都明显上调,ERK磷酸化水平上调,加入抑制剂后磷酸化下调并且细胞增殖和侵袭能力也受到抑制,以上结果都说明了,PRDM5主要通过激活JNK和ERK信号通路进而促进B16F10细胞发生和转移。结论本实验结果显示,PRDM5对小鼠黑色素瘤细胞的增殖和转移具有促进作用,并且主要通过MAPK/JNK和ERK信号通路调节小鼠黑色素瘤的发生和转移,这将为PRDM5在癌症发生中的作用提供分子机制研究基础,最重要的是为临床治疗黑色素瘤提供新的思路。
【学位授予单位】：新乡医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.5

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本文编号：1231620