胸腺素β4对小鼠毛发生长的影响及其作用机制

发布时间：2017-12-20 01:31

  本文关键词：胸腺素β4对小鼠毛发生长的影响及其作用机制　出处：《内蒙古大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

  更多相关文章： 胸腺素β4 毛发生长 转基因小鼠 基因敲除小鼠 TALEN-Wnt MAPK PI3K

【摘要】：胸腺素β4 (Thymosin beta4, Tβ4)能够促进毛发生长和毛囊发育,然而其作用机制尚不明确。我们构建Tβ4表皮特异性过表达小鼠模型和全身性敲除小鼠模型,进一步研究Tβ4对毛囊发育与毛发生长的影响,并探索其作用机制。设计合适的靶位点和DNA识别序列,构建TALEN基因敲除载体。分别用TALEN基因敲除载体和表皮特异性载体的表达框进行原核注射,制备Tβ4敲除小鼠和表皮特异性过表达小鼠。通过脱毛实验比较三组小鼠的毛发生长速度。取脱毛部位皮肤组织做石蜡切片,通过HE染色观察毛囊分布,统计毛干数目；通过Tβ4蛋白免疫荧光染色,观察皮肤中Tβ4蛋白分布情况。通过real-time PCR 和 western blotting技术检测上述样品中Tβ4、血管内皮生长因子(VEGF)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和钙粘蛋白(E-cad)的mRNA和蛋白表达水平,接着检测Wnt、MAPK和PI3K信号通路的活性,探索Tβ4影响毛发生长的作用机制。1、TALEN基因敲除载体和表皮特异性过表达载体的构建根据Tβ4的编码序列(CDs)设计合适的靶位点和DNA识别序列,构建TALEN基因敲除载体。用构建好的6组TALEN敲除载体转染小鼠NIH3T3细胞,从中筛选出打靶效率最高的一组L1×R3,打靶效率为93%,进行原核注射,制备Tβ4全身性敲除小鼠。将pODsRed-KTP1载体上包含Krt14启动子、Tβ4的CDs区和polyA序列的片段(KTP片段)切下并纯化后,进行原核注射制备Tβ4表皮特异性过表达小鼠。2、Tβ4敲除小鼠和过表达小鼠的制备原核注射时,225枚注射后胚胎移植到7只受体鼠体内,得到40只新生小鼠,其中3只Tβ4表皮特异性过表达小鼠,阳性率分别为7.5%；127枚注射后胚胎移植到5只受体鼠体内,得到25只新生小鼠,其中8只敲除小鼠,突变率为32%。3、Tβ4对小鼠毛发生长的影响用松香蜡对8-10周龄的野生型小鼠、Tβ4全身性敲除小鼠和表皮特异性过表达小鼠进行脱毛实验,刺激毛发同步生长。在三组实验小鼠脱毛后第11天拍照,记录毛发的生长情况。观察发现：野生型小鼠脱毛后第13天、Tβ4敲除小鼠脱毛后第16天和过表达小鼠脱毛后第11天,其脱毛部位毛发生长情况相同。取三组小鼠脱毛部位的皮肤,制作石蜡切片并进行Tβ4蛋白免疫荧光染色和HE染色,观察Tβ4在小鼠皮肤中的分布情况和其对毛囊排列方式和毛干数目的影响。与野生型小鼠相比,Tβ4过表达小鼠长毛速度最快、被毛较长且厚,而全身性敲除小鼠长毛速度较慢并且被毛没有长出体表。HE染色与免疫荧光染色的结果表明,对照组小鼠的毛囊独立地分布,Tβ4只分布在毛囊周围的细胞中；而Tβ4过表达小鼠的毛囊成簇生长,毛干数目显著提高,Tβ4几乎分布于整个皮肤中；Tβ4敲除小鼠的毛囊独立地排列,与对照组小鼠相比毛干数目显著减少,且在毛囊周围细胞与组织中未见Tβ4的分布。4、Tβ4影响毛发生长的作用机制与对照组相比,Tβ4过表达小鼠体内Tβ4的mRNA水平和蛋白水平表达量升高(P0.05),VEGF和MMP-2的mRNA和蛋白表达水平也增加(P0.05),而E-cad的mRNA水平和蛋白表达量没有明显变化(P0.05)；在敲除小鼠体内VEGF和MMP-2的表达水平显著降低(P0.05),E-cad的表达水平保持稳定(P0.05)。Wnt信号通路中P-catenin和LEF-1蛋白表达量的变化与Tβ4表达水平的变化趋势一致。在过表达小鼠体内,与对照组相比P38、ERK1/2和AKT的蛋白表达量以及磷酸化水平均提高；在敲除小鼠体内P38、ERK1/2和AKT的蛋白表达量显著降低,而只有ERK1/2的磷酸化水平显著降低(P0.05)。综上所述,我们认为在成熟小鼠皮肤中,Tβ4通过Wnt/β-catenin/LEF-1信号通路,调控VEGF和MMP-2的表达。两方面相互促进共同作用,进一步影响MAPK/P38、MAPK/ERK1/2和PI3K/AKT途径活性的改变,调控毛发生长速度、毛干的数目与毛囊分布,最终影响毛囊生长发育。
【学位授予单位】：内蒙古大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R758.71

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本文编号：1310269