microRNA-217对人皮肤成纤维细胞衰老的作用及机制研究

发布时间：2017-12-27 21:18

本文关键词：microRNA-217对人皮肤成纤维细胞衰老的作用及机制研究　出处：《中南大学》2014年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：生物体衰老是一个包含不同器官和系统的、发生一系列特定变化的复杂过程。皮肤衰老是机体衰老最直接的表现,本质和基础是皮肤细胞的衰老,其不仅受控于遗传基因的调节,也受控于表观遗传的调控,后者是衰老发生的重要机制,包括DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑及microRNA (miRNA)调控等。 miRNA-217是一种已知高表达于人脐静脉内皮细胞及人冠状动脉内皮细胞中的miRNA,已被证实其在胰腺导管腺癌中能通过靶向调控KRAS起到肿瘤抑制因子的作用,还可靶向调节Runx2,从而影响成骨细胞成熟。在衰老机制的研究中,已有报道显示,miR-217在衰老的血管内皮细胞中表达上调,并可通过抑制长寿基因Sirt1的表达导致血管内皮细胞的衰老。然而,至目前为止,miR-217对于皮肤衰老的作用研究还不清楚。本课题组前期通过miRNA芯片发现传代衰老组与年青组人皮肤成纤维细胞(Human skin fibroblasts, HSF)比较,miR-217的表达量明显增加。因此,我们推测miR-217可能在HSF衰老中起到了重要作用。本研究通过三个部分证实miR-217在HSF衰老中的作用机制。第一部分：检测比较年青组与衰老组HSF中miR-217的表达。第二部分：研究miR-217在HSF衰老过程中的作用。通过在年青组HSF中过表达miR-217并检测细胞衰老的表型及相关衰老蛋白的表达,以探讨miR-217在细胞衰老中的作用。第三部分：研究miR-217调控HSF衰老的机制：(1)通过生物信息学预测,发现miR-217可能直接靶向DNA甲基化转移酶1(DNMT1),利用双荧光素酶报告基因系统证明两者的直接靶向关系；(2)在HSF中,检测miR-217对DNMT1表达量的调节,及其通过DNMT1对细胞衰老调节的机制。通过以上研究揭示miR-217能够通过下调DNMT1来促进HSF的衰老,为皮肤衰老的研究和治疗领域提供新的方向。第一部分年青组与衰老组人皮肤成纤维细胞中miR-217的表达目的：检测自然衰老与传代衰老HSF中miR-217的表达水平。方法：收取少年组(10岁)、中年组(30～50岁)与老年组(60岁)的正常人避光部位皮肤,原代培养HSF,并将少年组HSF进行传代(年青组：P3-5,衰老组：P20-25),采用Real-time PCR方法检测miR-217的表达量。结果：和少年组细胞比较,中年组、老年组HSF中的miR-217表达量明显升高(中年组：P0.05,老年组：P0.01),其中老年组较中年组细胞中miR-217的表达量也显著升高(P0.01)。和年青组细胞比较,传代衰老组细胞的miR-217的表达量亦明显升高(P0.01)。结论：自然衰老与传代衰老的HSF中miR-217的表达明显上升。第二部分miRNA-217对人皮肤成纤维细胞衰老的作用目的：研究miR-217在HSF衰老过程中的作用。方法：在年青组HSF中,通过稳定转染hsa-miR-217的慢病毒和阴性对照慢病毒,48小时后,采用Real-time PCR方法检测miR-217的表达量,MTT法检测HSF细胞增殖能力,衰老β-半乳糖苷酶染色法检测HSF的衰老相关染色率,western blot法检测衰老相关蛋白P53、P21、sirt1等的改变。结果：转染hsa-miR-217的慢病毒后,HSF中的miR-217表达量显著上调(P0.01),细胞增殖能力明显下调(P0.05),衰老β-半乳糖苷酶染色率明显上升(P0.01),衰老相关蛋白P53、P21的表达量上升、sirt1表达量下降(P0.05)。结论：过表达miR-217可明显促进HSF的衰老,miR-217在HSF的衰老过程中起到重要作用。第三部分miRNA-217直接调控HSF中DNMT1的表达及机制目的：研究miR-217在HSF衰老过程中的调控机制。方法：通过MICRORNA.ORG网站预测DNMT1是否为hsa-miR-217可能的直接靶向基因,并构建DNMT1的3'UTR区域的野生型与突变型的荧光素酶报告基因质粒,在293T细胞中,分别转染野生型与突变性DNMT1-3'UTR质粒,4小时后将miR-217化学模拟物(mimics)转染细胞,48小时后溶解细胞,荧光素酶检测系统分析荧光强度。构建含DNMT1shRNA序列的慢病毒载体,通过在年青组HSF中抑制DNMT1的表达量来检测HSF的衰老表型。利用第二部分中稳定转染的年青组HSF,提取细胞总蛋白,利用western blot法检测DNMT1的蛋白表达量,并在过表达miR-217的年青组HSF中,转染DNMT1-cDNA质粒,衰老β-半乳糖苷酶染色法检测HSF的衰老相关染色率。结果：MICRORNA.ORG网站预测到miR-217的3'UTR区域可以直接靶向DNMT1的序列。荧光素酶报告基因检测显示,野生型的DNMT1-3'UTR质粒转染后,过表达miR-217后,荧光量较未过表达组下降(P0.05),而突变型的DNMT1-3'UTR转染组未发生明显变化。年青组HSF中抑制DNMT1的表达量后,细胞增殖能力明显减弱(P0.05),衰老β-半乳糖苷酶染色率明显上升(P0.01)；年青组HSF中过表达miR-217后,DNMT1的蛋白表达量明显下降(P0.01)；同时转染含hsa-miR-217shRNA和DNMT1-shRNA序列的慢病毒载体后,较单独下调hsa-miR-217组,衰老β-半乳糖苷酶染色率上升(P0.05)。结论：DNMT1是miR-217的调控的靶基因,miR-217可直接靶向结合DNMT1的3'UTR区；传代衰老的HSF中DNMT1表达量明显下降,抑制DNMT1的表达量后,可以明显促进HSF的衰老；miR-217通过抑制DNMT1的表达量从而促进HSF的衰老。
[Abstract]:Biological aging is a complex process that contains different organs and systems and has a series of specific changes. Skin aging is the most direct manifestation of aging, is the essence and basis of the aging of skin cells, the regulation is not only controlled by genes, also controlled by epigenetic regulation, which is an important mechanism of aging, including DNA methylation, histone modification, chromatin remodeling and the regulation of microRNA (miRNA).
【学位授予单位】：中南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R751

【参考文献】