小鼠骨髓源性DC的提取及其与恶性黑色素瘤细胞融合细胞制备的研究

发布时间：2016-10-22 07:12

  本文关键词：小鼠骨髓源性DC的提取及其与恶性黑色素瘤细胞融合细胞制备的研究，由笔耕文化传播整理发布。

《大连医科大学》 2012年

小鼠骨髓源性DC的提取及其与恶性黑色素瘤细胞融合细胞制备的研究

史鹏  

【摘要】：目的：探讨GM-CSF和IL-4剂量的变化对原代小鼠骨髓源性树突状细胞提取数量、纯度的影响以及应用PEG法制备树突状细胞和恶性黑色素瘤细胞融合细胞时的适宜分子。 方法：取4周SPF级雄性C57BL/6小鼠，断颈处死，分离出小鼠股骨和胫骨，取骨髓细胞，应用完全培养基重悬细胞，接种于6孔板中，每孔加1.5ML完全培养基，然后置入含5%CO2浓度37℃恒温培养箱内。贴壁3小时后，弃上清，用含有不同剂量GM-CSF（200,500,1000）和IL-4（200,500,1000）的1640培养基培养，第5天加入TNF-α1.5ML刺激细胞成熟。分别对不同分组的细胞，倒置显微镜下观察细胞形态，细胞计数板计数，流式细胞术分析树突状细胞不同成熟度下细胞因子（MHC-Ⅱ、CD11c、CD80、CD83）表达的变化、测定细胞纯度，，免疫荧光技术测定成熟细胞因子CD83表达。将培养至第七天的成熟树突状细胞和对数生长期的恶性黑色素瘤细胞制备成单细胞悬液，用不完全培养基重悬。应用PKH67-GL和PKH26-GL分别染色树突状细胞和恶性黑色素瘤细胞。分别应用PEG-3000和PEG-4000制备融合细胞。倒置荧光显微镜下观察细胞的融合过程，并进行融合细胞纯度和数量的估算。 结果：加入GM-CSF浓度为1000U/ml，IL-4浓度为500U/ml组的树突状细胞，细胞密度适中，伪足状的树突结构明显，呈现典型的树突状细胞结构，明显的优于其他3组（P0.05）。流式细胞术分析细胞表型的变化证明了树突状细胞成熟度改变而致细胞表型变化的特性。免疫荧光检测成熟树突状细胞，可见细胞高表达CD83。应用PEG-3000制备的融合细胞，在倒置荧光显微镜下观察，可见大量PKH67-GL（绿色）与PKH26-GL（红色）染色后的细胞，同时可见激发出黄光，细胞体积较上述两种细胞大的融合细胞，融合率约40%-50%，细胞密度和融合率明显高于PEG-4000制备的细胞。 结论：1、不同浓度浓度的刺激因子影响原代的提取数量和纯度，提取原代细胞刺激因子适宜的浓度分别为GM-CSF：1000U/ML；IL-4：500U/ML。2、PEG-3000在分子量上最适宜制备树突状细胞和恶性黑色素瘤细胞融合细胞。

【关键词】：
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R739.5
【目录】：

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