CRT、gC1qR及其复合体在氧化应激诱导细胞损伤中的作用机制

发布时间：2018-02-24 13:14

本文关键词： 钙网织蛋白(CRT) C1q受体球状结构域(gC1qR) CRT/gC1qR复合体黑素细胞氧化应激内质网应激白癜风　出处：《第四军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:黑素细胞破坏或凋亡导致白癜风发病的机制是皮肤科研究热点之一。越来越多的证据表明,氧化应激直接导致黑素细胞损伤或凋亡并启动异常免疫应答,是寻常型白癜风发病的重要机制。钙网织蛋白(CRT)又称cC1qR,是补体C1q的主要受体之一,而C1q的另一受体gC1qR表达于除红细胞外的几乎所有哺乳动物细胞,在炎症反应、病毒感染、肿瘤转移、调控细胞凋亡中有重要作用。gC1qR进入细胞线粒体内蓄积,能导致线粒体功能障碍,促进凋亡;而gC1qR与CRT形成CRT/gC1qR复合体则可阻止gC1qR线粒体和核转位,促进细胞增殖或迁移。氧化应激可影响CRT、gC1qR蛋白表达和亚细胞定位,但在表皮组织中,角质形成细胞与黑素细胞应对氧化损伤有不同模式,CRT、gC1qR的定位及功能变化尚不明确,CRT/gC1qR复合体的存在与否对两种细胞的影响也亟待阐明。课题组前期的研究发现:过氧化氢(H2O2)诱导氧化应激时,黑素细胞中的CRT翻转至细胞膜表面,促进部分炎症因子的表达。提示白癜风发病早期,氧化应激介导黑素细胞免疫原性增强,启动并促进自身免疫应答。但CRT膜外翻的具体机制尚不明确,更关键的是尚未获得crt参与黑素细胞免疫损伤的确切证据;另外,角质形成细胞中相关分子的表达也值得关注。基于前述结果,我们提出如下假说:氧化应激诱导黑素细胞内部显著的内质网和线粒体应激,导致crt膜外聚集,gc1qr发生线粒体转位,二者共同作用促进细胞凋亡;而角质形成细胞中,crt与gc1qr形成crt/gc1qr复合体,降低细胞损伤。目的:1.探讨氧化应激下调控crt的信号通路及crt在氧化应激介导黑素细胞免疫损伤中的证据;2.明确gc1qr、crt/gc1qr复合体在黑素细胞和角质形成细胞中的表达模式及参与氧化损伤的机制。方法:1.应用激光共聚焦组织免疫荧光技术,观察白癜风患者及正常人表皮黑素细胞中crt定位的差异;2.通过应用流式细胞术检测细胞早凋/坏死比例,体外构建h2o2诱导的黑素细胞及角质形成细胞氧化应激模型,应用细胞免疫荧光技术观察细胞模型中crt的定位;3.应用real-timepcr、westernblot筛选上游调控crt表达的信号通路;并通过干涉片段对初筛结果进行验证,激光共聚焦组织免疫荧光技术观察白癜风患者及正常人表皮中所筛选相关通路标志分子的表达;同时通过分离胞膜蛋白,进一步明确上游信号对亚细胞结构中crt的调控机制;4.建立pig1细胞与白癜风患者pbmc共孵育模型,应用流式细胞术及elisa检测不同条件处理后的共孵育模型中cd8+t细胞的增殖、细胞因子ifn-γ的表达水平、dc细胞成熟标志物cd80、cd86、hla-dr的表达差异;5.应用real-timepcr、westernblot技术检测细胞氧化应激模型中gc1qr的表达,并应用激光共聚焦免疫荧光观察gc1qr的亚细胞器定位变化;6.应用免疫共沉淀技术分析氧化应激模型中crt与gc1qr的相互作用及crt/gc1qr复合体的形成,并通过westernblot、细胞免疫荧光技术观察crt、gc1qr、crt/gc1qr的表达与定位情况;7.分别应用crt与gc1qr的干涉片段处理细胞后,观察氧化应激条件下二者及crt/gc1qr复合体对细胞凋亡、线粒体膜电位及细胞ros水平的影响;8.通过质谱分析及string在线软件对黑素细胞氧化应激模型中影响crt/gc1qr复合体形成的靶蛋白进行预测和分析。结果:1.crt生理、病理状态的定位:(1)正常人表皮组织中的黑素细胞crt定位于胞浆;而白癜风表皮组织中残留的黑素细胞crt表达增加且于胞膜上出现crt的定位;(2)浓度梯度h2o2处理黑素细胞(pig1、原代mc)及作为对照的角质形成细胞(hacat、原代kc)12h,流式细胞术检测细胞凋亡并选择早期凋亡有统计学差异而坏死无差异的h2o2浓度作为所构建氧化应激模型的实验浓度,即pig1与原代mc细胞为:400μm,hacat及原代kc细胞为:800μm;本实验浓度可以成功诱导黑素细胞中crt与dii标记的细胞膜共定位(crt膜外翻/聚集),并可以在mrna及蛋白水平以时间梯度依赖性诱导crt的上调;角质形成细胞中未见时间依赖性的crt膜外翻。2.氧化应激诱导crt与gc1qr表达与功能变化:(1)h2o2构建的黑素细胞氧化应激模型引起gc1qr的表达上调及线粒体转位,且具时间依赖性;与黑素细胞不同的是,角质形成细胞氧化应激模型中gc1qr的表达下调,且主要表达于细胞浆,并未发生显著的线粒体转位;(2)黑素细胞氧化应激模型诱导的crt膜聚集和gc1qr线粒体转位,两者在细胞内无共定位现象;而角质形成细胞氧化应激模型则诱导部分crt与gc1qr形成复合体。3.crt与gc1qr在氧化应激损伤细胞中的机制:(1)体外氧化应激模型可以诱导黑素细胞未折叠蛋白反应upr发生的同时,激活内质网应激经典的信号通路;其中perk相关通路的激活主要调控了黑素细胞crt的膜聚集,且具有显著的时间依赖性;白癜风皮损旁组织与正常对照组织相比磷酸化perk高表达;irei"及atf6相关通路的激活与黑素细胞膜型crt的表达无关;(2)体外与hla分型一致的患者pbmc构建的共孵育模型发现,黑素细胞crt的膜聚集导致cd8+t细胞增殖并促进ifn-#的产生;同时可以促进dc细胞表面成熟标志物cd86及hla-dr的表达;(3)氧化应激下,黑素细胞中的CRT与gC1qR均参与细胞的凋亡,发挥促凋亡的作用,其中CRT主要导致细胞早期凋亡,gC1qR可以导致线粒体内膜发生去极化、膜电位下降,并引起胞内ROS的蓄积;与黑素细胞相反,角质形成细胞中CRT/gC1qR复合体的形成阻止了CRT引起的细胞早凋、gC1qR诱导的线粒体膜电位下降及胞内ROS的蓄积;SRSF1、NCAPD2、HSP90AA1、SCARF1、TUBB2C可能与黑素细胞CRT竞争结合gC1qR从而诱导细胞凋亡。结论:1.本课题阐明了氧化应激条件下,调控白癜风黑素细胞CRT膜聚集的上游分子通路,证实CRT膜聚集可诱导黑素细胞免疫损伤,明确了CRT、gC1qR在氧化应激黑素细胞损伤中的作用;2.揭示黑素细胞与角质形成细胞中CRT、gC1qR不同表达模式的分子基础,对阐明和理解氧化应激诱发白癜风的机制具有重要意义。
[Abstract]:BACKGROUND : The pathogenesis of vitiligo is one of the hot spots in Dermatology . It is shown that oxidative stress plays an important role in the pathogenesis of vitiligo . the expression of cd8 + t cells , the expression of cd8 + t cells , the expression of cd8 + t cells , the expression of cd8 + t cells and the expression of cd8 + t cells in the epidermal tissues of normal controls were investigated by means of immuno - co - precipitation technique . ( 1 ) In vitro oxidative stress model , CRT and gC1qR are involved in the proliferation of the cells and the accumulation of intracellular ROS . ( 2 ) In vitro , CRT / gC1qR induces apoptosis in the cells and promotes the accumulation of intracellular ROS .

【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R758.41

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