梅毒螺旋体体外活化人脑微血管内皮细胞的实验研究

发布时间：2018-03-01 13:36

  本文关键词： 梅毒螺旋体 人脑微血管内皮细胞 粘附 基因芯片 趋化因子　出处：《北京协和医学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分 梅毒螺旋体粘附于人脑微血管内皮细胞的实验研究目的:观察梅毒螺旋体与体外培养的人脑微血管内皮细胞(HBMEC)的粘附方式和粘附规律。方法:将HBMEC接种于含细胞爬片的24孔细胞培养板中,加入8 × 106条/ml的梅毒螺旋体悬液共培养,分别于0.5、2、4h后使用扫描电镜分析梅毒螺旋体与HBMEC的粘附方式;加不同浓度(4 × 106条/ml、8 × 106条/ml、1.6 × 107条/ml)梅毒螺旋体悬液共培养,分别于2、4、6、16h后运用暗视野显微镜计数单个HBMEC上粘附的梅毒螺旋体数量。实验数据用重复测量资料的方差分析进行分析。结果:扫描电镜结果显示梅毒螺旋体集中粘附于HBMEC膜表面的某些区域,两者在粘附的部位可发生融合。时间与浓度间存在交互作用(F=98.74,P0.001),在各浓度组,不同时间点细胞上粘附的螺旋体数目间的差异均有统计学意义(F=387.72,P0.001),粘附的螺旋体数量随着共培养时间的延长而逐渐增多,4h时达到高峰,然后逐渐降低。在4h时,不同浓度组间细胞上粘附的螺旋体数目间的差异也具有统计学意义(F=593.23,P0.001)。结论:梅毒螺旋体可以粘附于体外培养的HBMEC,梅毒螺旋体可能是通过菌体尖端与细胞膜溶解的方式与HBMEC粘附;1.6 × 107条/ml和共培养4h分别是梅毒螺旋体与HBMEC粘附的最佳浓度和时间。第二部分梅毒螺旋体刺激后人脑微血管内皮细胞基因表达谱分析及差异表达基因的功能分析目的:探讨梅毒螺旋体粘附对人脑微血管内皮细胞(HBMEC)基因表达谱的影响,分析差异表达基因的功能,从mRNA水平了解HBMEC对梅毒螺旋体的反应。方法:构建HBMEC单层模型,加入1.6 ×107条/ml的梅毒螺旋体悬液,以未加螺旋体的HBMEC作为对照,4h后提取细胞RNA,利用Agilent SurePrint G3 Human Gene Expression Microarray(8×60K)基因芯片检测 HBMEC 的基因表达谱,筛选差异表达基因。利用GO和KEGG富集法分析差异表达基因的功能,利用qRT-PCR对7个感兴趣的差异表达基因进行验证。结果:基因芯片共筛选出249个差异表达的基因,包括218个上调表达的基因和31个下调表达的基因。GO富集分析结果显示差异表达基因共参与38个GO terms,其中生物学过程、分子功能、细胞成分的terms数目分别为27、6和5,内皮细胞活化、宿主细胞免疫反应和细菌粘附等多个生物学过程。KEGG富集分析结果显示差异表达基因富集于12条信号通路中,两者相互作用过程可能涉及 Th1 7 cell differentiation 通路和 Cell adhesion molecules 通路。qRT-PCR 结果显示 RARRES2、ADAMTS5、F3、MACF1 和 DCN 表达上调,CLDN4和LDLR表达下调,与基因芯片结果基本一致。结论:梅毒螺旋体可改变HBMEC的基因表达谱,差异表达基因广泛参与多个生物学过程。梅毒螺旋体粘附后的HBMEC被激活,同时发起一系列免疫防御对抗螺旋体的侵袭。该基因芯片分析结果为进一步研究人脑微血管内皮细胞在神经梅毒发病机制中的作用提供新的平台和研究方向。第三部分梅毒螺旋体对人脑微血管内皮细胞中多个趋化因子配体表达的影响目的:探索梅毒螺旋体对HBMEC中趋化因子配体(CXCL)表达的影响。方法:将HBMEC接种于6孔或96孔细胞培养板中,分为梅毒螺旋体组、灭活梅毒螺旋体、脂多糖组和空白对照组,分别加入梅毒螺旋体、灭活的梅毒螺旋体、脂多糖和细胞培养液培养,于6、12、24h后分别用荧光定量PCR和酶联免疫吸附试验检测细胞中CXCL-6、CXCL-8、CXCL-10和CXCL-13的基因表达水平和蛋白表达水平。利用Transwell小室细胞迁移实验检测梅毒螺旋体刺激后HBMEC对人早幼粒细胞白血病细胞(HL-60)的趋化作用。结果:在各时间点,梅毒螺旋体组中CXCL-6、CXCL-8和CXCL-10的mRNA表达水平均显著高于空白对照组和灭活梅毒螺旋体组(均P0.05),而灭活梅毒螺旋体组与空白对照组之间的差异无统计学意义(均P0.05)。各组细胞中CXCL-13的mRNA表达差异无统计学意义。在各时间点,梅毒螺旋体组中CXCL-6和CXCL-8的含量均高于空白对照组和灭活梅毒螺旋体组(均P0.05),而灭活梅毒螺旋体组与空白对照组间差异无统计学意义(均P0.05);在各时间点,梅毒螺旋体组细胞培养上清液中CXCL-10的含量与空白对照组和灭活梅毒螺旋体组间差异无统计学意义(均P0.05)。在各时间点,梅毒螺旋体组的吸光值均高于空白对照组和灭活梅毒螺旋体组(均P0.05)。结论:梅毒螺旋体可上调HBMEC中CXCL-6、CXCL-8和CXCL-10的基因表达水平,增加CXCL-6和CXCL-8的分泌,增强HBMEC对HL-60细胞的趋化作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R759.1

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本文编号：1552197