丙肝和梅毒抗体的灰区标本假阳性结果分析及梅毒抗体检测方法改进的研究

发布时间：2018-03-13 09:23

本文选题：丙型肝炎抗体　切入点：梅毒抗体　出处：《广州医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景丙型肝炎和梅毒是常见血液传播性疾病。丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus,HCV)感染可造成急性或慢性肝炎,会发展为肝硬化或肝癌。梅毒螺旋体(Treponema Pallidum,TP)感染可损害人体多系统多器官,导致组织破坏、功能丧失,甚至危及生命,并能母婴传播,威胁下一代健康。世界卫生组织(World Health Organization,WHO)报告,丙肝和梅毒发病率呈逐年上升趋势,现已成为严重的公共卫生问题。目前尚无能预防HCV和TP感染的有效疫苗。这两种疾病感染初期往往无明显的临床症状和体征,易造成漏诊,延迟治疗。实验室结果作为主要临床诊断指标,结果准确对临床诊疗与阻断疾病的传播具有重要意义。近年来,酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和化学发光免疫分析(Chemiluminescent immunoassay,CLIA)因其通量大、自动化程度高、易于标准化等优点,已广泛应用于无症状人群的筛查和疾病诊断。但许多研究表明,ELIA和CLIA两种筛查试验均存在一定比例的假阳性,尤其在低感染流行人群中会出现较高的假阳性。假阳性结果会带给受检者不必要的就医和心理伤害,需要引起重视。影响产生假阳性的因素目前尚不明确。不同检测方法的假阳性率不同,这可能与方法使用的反应体系、抗原成分和抗原表位等有关。TP47蛋白是梅毒螺旋体中丰度最高、抗原性强和特异性高的抗原,是用于检测梅毒特异性抗体的主要抗原之一。研究报道,TP47中有一段与人纤维连接蛋白有较高的同源性的序列,这可能和某些自身免疫性病人血清与梅毒检测试剂发生交叉反应有关。利用生物信息学技术预测特异性抗原表位,去掉特异性差的片段,降低引起交叉反应的可能性。这种抗原表位的应用可能会降低假阳性反应,提高检测方法的特异性。研究目的1.探讨Architect i2000和HISCL 5000两种化学发光方法检测抗HCV抗体(Hepatitis C virus antibody,Anti-HCV)和抗TP抗体(Treponema Pallidum antibody,Anti-TP)灰区标本的假阳性结果情况,为HCV和TP的诊断和治疗提供应用参考。2.建立TP47E抗原表位蛋白和TP47全蛋白的双抗原夹心ELISA,比较两方法检测梅毒抗体的敏感性和特异性,探索利用抗原表位解决假阳性问题方案的可行性。研究方法1.收集本院Architect i2000检测Anti-HCV筛查阳性结果(1≤S/CO≤5)的样本161例。全部样本均进行HISCL 5000检测。以高敏HCV核酸(Ribonucleic acid,RNA)定量和重组免疫印迹试验(Recombinant immune blot assay,RIBA)的结果为标准确定真、假阳性。采用SPSS 21.0统计软件进行单因素方差分析和LSD-t检验。P0.05为差异有统计学意义。2.收集本院Architect i2000检测Anti-TP筛查阳性结果(1≤S/CO≤10)的样本334例。全部样本均进行HISCL 5000检测和梅毒螺旋体抗体明胶颗粒凝集试验(Treponema Pallidum particle agglutination assay,TPPA)检测。两种化学发光方法检测结果不一致的标本进行RIBA检测。以TPPA和RIBA的结果为标准确定真、假阳性。采用SPSS 21.0统计软件进行单因素方差分析和LSD-t检验。P0.05为差异有统计学意义。3.利用EMBOSS、Bepipred和IEDB预测软件进行B细胞表位预测。根据上述预测软件的结果,选取TP47的81-120的氨基酸序列作为优势抗原表位,应用基因工程技术,构建原核表达载体pET28b-TP47E,重组质粒经酶切和测序鉴定,并转化至E.coli BL21中,IPTG诱导表达、镍离子亲和层析柱纯化和免疫印迹法(Western Blot,WB)鉴定。4.采用过碘酸钠法标记重组蛋白作酶标抗原,以重组蛋白作包被抗原,建立双抗原夹心ELISA,优化抗原包被浓度、包被方式、封闭条件、血清稀释倍数、血清反应时间、酶标抗原浓度、酶标抗原反应时间和底物反应时间等条件,并检测46份TPPA阴性血清和91份Architect i2000检测结果处于灰区的标本(1≤S/CO≤10),比较TP47E抗原表位蛋白和TP47全蛋白的双抗原夹心ELISA的敏感性和特异性。研究结果1.HISCL检测Anti-HCV结果阳性的标本有23例,阴性的有138例,两化学发光法的Anti-HCV结果一致率为14.3%(23/161)。所有标本的HCV RNA定量检测结果均阴性。RIBA检测13例结果阳性,45例不确定,103例阴性。Architect和HISCL与RIBA的总一致率分别为8.1%(13/161)和69.6%(112/161),Architect假阳性标本占其总阳性标本的91.9%(148/161);HISCL假阳性标本占其总阳性标本的52.2%(12/23)。HISCL方法检测的标本RIBA阳性组、不确定组和阴性组的平均COI值分别为3.0、1.0和0.2,三组间的COI值差异有统计学意义(P=0.0000.01);Architect方法检测的标本RIBA阳性组、不确定组和阴性组的平均COI值分别2.8、2.2和2.0,三组间的S/CO值差异有统计学意义(P=0.0270.05)。2.HISCL检测Anti-TP结果阳性的标本有209例,阴性的有125例,两化学发光法的Anti-TP结果一致率为62.6%(209/334)。以TPPA为标准,Architect和HISCL的结果与TPPA的总一致率分别为61.7%(206/334)和85.3%(285/334)。Architect假阳性标本占其总阳性标本的38.3%(128/334);HISCL假阳性标本占其总阳性标本的12.4%(26/209)。TPPA阳性组和阴性组的Architect平均S/CO值、HISCL平均COI值分别为4.8和2.5、3.9和0.8,两组间的S/CO值或COI值差异均有统计学意义(均为P=0.0000.01)。Architect阳性而HISCL阴性的125例标本经RIBA检测,6.4%标本阳性(8/125),26.4%不确定(33/125),67.2%阴性(84/125)。3.综合分析B细胞表位预测结果,选取TP47位于81-120的氨基酸序列作为优势抗原表位,标记为TP47E,其氨基酸序列为AFRQQFQYAVEVLGEK VLSKQETEDSRGRKKWEYETDPSV。PCR扩增获得编码TP47E蛋白的基因序列,构建的原核表达载体pET28b-TP47E,测序结果表明,其碱基序列与Gen Bank中的基因序列一致,经IPTG诱导表达、镍离子亲和层析柱纯化和免疫印迹法获得了重组TP47E抗原表位蛋白。4.采用过碘酸钠法标记重组蛋白,获得酶标抗原。基于TP47E抗原表位蛋白和TP47全蛋白建立的双抗原夹心ELISA,其最佳抗原包被浓度分别为1μg/mL和0.5μg/mL、最佳包被方式为37℃2h后4℃过夜,最佳封闭条件为1%BSA和4℃过夜,最佳血清稀释度为血清原液,最佳血清反应时间为90min,最佳酶标抗原浓度为1μg/mL,最佳酶标抗原反应时间为30min,最佳底物反应时间为10min。TP47E的ELISA法的敏感性和特异性为81.3%(47/58)和94.0%(31/33),TP47的ELISA法的敏感性和特异性为93.2%(55/59)和78.8%(26/33)。结论1.Architect i2000和HISCL 5000两种化学发光法检测Anti-HCV和Anti-TP的灰区标本均出现较高假阳性,假阳性原因还需进一步深入研究,迫切需要研发特异性更高的Anti-HCV和Anti-TP的实验室筛查方法。2.本文成功建立了TP47E抗原表位和TP47全蛋白的双抗原夹心ELISA方法并比较两者的敏感性和特异性。TP47E抗原表位ELISA方法的敏感性不足,但与TP47全蛋白比较,明显提高了检测的特异性,初步显示通过优化抗原能提高检测特异性。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R759.1;R446.6;R512.63

【参考文献】