过表达microRNA-23a对急性UVB照射所致皮肤光损伤干预作用及其相关靶基因预测结果验证的研究

发布时间：2018-04-17 08:01

本文选题：黄芩苷 + 中波紫外线　；参考：《南京医科大学》2011年硕士论文

【摘要】：研究背景和目的: 紫外线(UV)辐射是皮肤癌发病病因中重要的环境因素,在相同剂量下,UVB(290-320nm)的光损伤作用比UVA约大800-1000倍,因此日光辐射的致癌效应主要归因于UVB部分。中药黄芩的主要活性成分黄芩苷是有着广泛生物学效应的黄酮类抗氧化剂,具有抗炎、抗氧化及抗肿瘤等作用。本实验小组既往研究表明黄芩苷能明显减轻UVB照射引起的小鼠表皮DNA损伤并加速光产物清除,此外外用黄芩苷可拮抗单次大剂量UVB照射造成的红斑、水肿及真皮炎症细胞浸润,从而提示黄芩苷可能对紫外线诱导的皮肤肿瘤形成具有一定的拮抗作用。然而既往研究均建立在单次UVB照射的条件下,黄芩苷是否对反复UVB照射造成的小鼠皮肤损伤具有拮抗作用,并且其可能的抗光损伤作用机制尚未被彻底阐述。COX-2是催化花生四烯酸生成前列腺素的限速酶,具有促细胞增殖作用,参与多种癌前病变和恶性肿瘤的发生发展。Ki-67和PCNA与细胞有丝分裂密切相关,是细胞周期相关核抗原,可作为评价细胞增殖状态的指标。本部分研究以C57BL/6小鼠为实验对象,参照Katiyar等人以及本研究小组的既往研究,采用180mJ/cm2剂量UVB隔天照射一次、共10次的方法建立反复UVB照射损伤的动物模型,并外用黄芩苷溶液预处理背部照射区,采用HE染色、免疫组化及Western blot等多种方法观察黄芩苷对反复UVB照射后小鼠表皮厚度、COX-2、Ki-67及PCNA蛋白表达的影响,研究其抗光损伤作用的可能机制。方法: 1.以6周龄大的雌性C57BL/6小鼠为研究对象,随机分为对照组、UVB组、黄芩苷组和黄芩苷+UVB组,其中,UVB组和黄芩苷+UVB组小鼠用180mJ/cm2 UVB照射背部皮肤,隔天1次,共10次;黄芩苷组和黄芩苷+UVB组小鼠于照射前30分钟在背部预照射区涂抹丙酮溶解的黄芩苷溶液(1mg/cm2)。末次UVB照射后24小时处死小鼠,取其背部皮肤以备后续实验; 2.取小鼠背部皮肤切片,HE染色观察皮肤病理变化; 3.取小时背部皮肤切片,免疫组织化学法观察皮肤组织中COX-2、Ki-67及PCNA蛋白表达的变化; 4.取小鼠背部皮肤,分离提取组织总蛋白,Western blot法检测皮肤组织中COX-2、Ki-67及PCNA蛋白表达的变化。结果: 1黄芩苷减轻UVB照射所致小鼠皮肤病理变化 UVB照射诱导小鼠表皮层厚度增加,约5-8层角质形成细胞厚度,真皮乳头水肿,局灶性真皮浅血管周围有以淋巴细胞为主的单一核细胞浸润。黄芩苷可减轻UVB照射引起的组织病理改变,表现为表皮层增厚受抑制,厚度仅3-5层角质形成细胞,真皮层水肿及单核细胞浸润减轻; 2黄芩苷降低UVB照射所致COX-2蛋白的表达自然状态下COX-2在对照组和黄芩苷组组织中呈低水平表达。UVB照射后COX-2阳性细胞数明显增加且蛋白表达水平升高,阳性细胞数达78.36±13.03%。黄芩苷+UVB组小鼠背部皮肤中COX-2阳性细胞数较单纯UVB照射组明显减少且蛋白表达水平降低,阳性细胞数仅为56.30±8.83%。黄芩苷+UVB组中COX-2蛋白表达水平虽然仍高于对照组,但较UVB组低,与UVB组比较差异具有统计学意义(P0.05),提示照光前局部使用黄芩苷可抑制UVB照射引起的COX-2蛋白表达水平增加; 3黄芩苷降低UVB照射所致Ki-67蛋白的表达自然状态下Ki-67在对照组和黄芩苷组组织中呈低水平表达。UVB照射后Ki-67阳性细胞数明显增加且蛋白表达水平升高,阳性细胞数达57.83±9.71%。黄芩苷+UVB组小鼠背部皮肤中Ki-67阳性细胞数较单纯UVB照射组明显减少且蛋白表达水平降低,阳性细胞数仅为38.69±11.76%。黄芩苷+UVB组中Ki-67蛋白表达水平虽然仍高于对照组,但较UVB组低,与UVB组比较差异具有统计学意义(P0.05),提示照光前局部使用黄芩苷可抑制UVB照射引起的Ki-67蛋白表达水平增加; 4黄芩苷降低UVB照射所致PCNA蛋白的表达自然状态下PCNA在对照组和黄芩苷组组织中呈低水平表达。UVB照射后PCNA阳性细胞数明显增加且蛋白表达水平升高,阳性细胞数达62.48±8.73%。黄芩苷+UVB组小鼠背部皮肤中PCNA阳性细胞数较单纯UVB照射组明显减少且蛋白表达水平降低,阳性细胞数仅为42.83±10.37%。黄芩苷+UVB组中PCNA蛋白表达水平虽然仍高于对照组,但较UVB组低,与UVB组比较差异具有统计学意义(P0.05),提示照光前局部使用黄芩苷可抑制UVB照射引起的PCNA蛋白表达水平增加。结论: 黄芩苷可减轻反复UVB照射所致的小鼠表皮增厚、水肿及真皮炎细胞浸润等损伤,同时降低小鼠表皮中COX-2、Ki-67及PCNA的表达,抑制UVB照射诱导的细胞增殖。提示黄芩苷可通过抑制UVB诱导的表皮细胞过度增生而发挥抗光损伤作用。研究背景和目的: microRNA(miRNA)是广泛存在于生命体中的一种正常调节机制,通过与靶mRNA的3’UTR(3’-untranslated region)碱基配对引导基因沉默复合物(RISC)抑制mRNA翻译或直接使其降解,使基因在转录后水平产生沉默,调控基因表达。miRNAs参与了动植物许多复杂的生命过程,包括细胞发育、器官生成、细胞凋亡、细胞增殖及肿瘤形成等。近来环境致癌物导致生物体miRNA表达发生变化的研究屡见报道,然而目前尚无关于抗光损伤药物miRNA靶位点的研究报告。发现并寻找出抗光损伤药物的核酸靶位点,对理解光源性皮肤损伤的发生机制有着重要意义,并对开发防治紫外线光损伤产品具有重要价值。本实验小组前期工作已在体内外实验中证实了黄芩苷可减轻UVB诱导的一系列皮肤光源性损伤,特别是黄芩苷可减少UVB照射后小鼠皮肤及人成纤维细胞中光产物环丁烷嘧啶二聚体(CPDs)的产生,并加速其清除。此外我们还用microRNA基因芯片技术筛选出对照组,UVB组以及黄芩苷+UVB组三组小鼠皮肤中差异表达的miRNAs,发现与对照组相比,UVB照射后小鼠皮肤中miRNA上调基因3个,下调基因3个。与UVB组相比,miR-23a是黄芩苷处理后唯一上调的miRNA,定量PCR方法也验证了芯片检测结果。 miR-23a是近年来研究较多的miRNA之一,是一种发挥类似癌基因或抑癌基因作用的miRNA。miR-23a作为黄芩苷处理后特异性上调表达的miRNA,提示miR-23a可能是参与黄芩苷抗光损伤作用的上游调节机制,然而目前尚无miR-23a在紫外线皮肤光损伤中作用的研究报告。miRNA mimics(模拟物)是根据成熟的miRNA设计的双链分子,已完成去保护、退火和纯化等处理过程,为即用型产品,具有稳定性好、可重复性强等优点。它模拟内源成熟miRNA的功能,可以增强内源miRNA的沉默作用,用于功能获得性研究。本实验中我们采用化学合成的miR-23a mimics转染HaCaT细胞的方法,观察过表达miR-23a对急性UVB照射所致皮肤光源性损伤的干预作用,并采用生物信息学分析预测其可能调控的靶基因,再通过文献查阅确定其发挥抗光损伤作用的可能靶基因,最后结合双荧光素酶报告基因实验和Western blot法通过检测miR-23a对其靶基因的影响验证生物信息学的靶基因预测结果。方法: 1.以HaCaT细胞为研究对象,随机分为对照组、UVB组、miR-23a Negative Control(阴性/空载对照)+UVB组和miR-23a mimics +UVB组,利用转染试剂将化学合成的miR-23a mimics/ Negative Control分别转染HaCaT细胞后接受30 mJ/cm2 UVB照射; 2.MTT法检测HaCaT细胞增殖活性; 3.流式细胞仪检测HaCaT细胞细胞周期及细胞凋亡率; 4.免疫荧光法、免疫印迹法检测HaCaT细胞中光产物CPDs的清除情况; 5.利用在线数据库targetscan预测miR-23a可能调控的下游靶基因,对所有靶基因进行基因本体论分析(GO-Analysis)和生物学通路预测,并通过文献检索选取与光损伤相关的靶基因拓扑异构酶Ⅰ(Top1)作为进一步研究对象; 6.构建融合靶基因Top1 3’UTR的双荧光素酶重组质粒,检测过表达miR-23a对Top1报告基因荧光素酶活性的影响; 7. Western blot法检测过表达miR-23a对UVB照射所致Top1蛋白表达的影响。结果: 1过表达miR-23a减轻UVB照射对HaCaT细胞增殖活性的抑制 30 mJ/cm2 UVB照射0、24、48和72小时后HaCaT细胞增殖活性下降,但转染miR-23a mimics预处理的HaCaT细胞在相同剂量UVB照射后的各个观测时点细胞增殖活性均明显高于单纯UVB组,提示过表达miR-23a可减轻UVB照射对细胞增殖活性的抑制作用; 2过表达miR-23a减轻UVB照射所致HaCaT细胞周期阻滞和细胞凋亡 HaCaT细胞在30 mJ/cm2 UVB照射后24小时大量停留在细胞周期的S期,即发生S期阻滞现象,而miR-23a mimics+UVB组S期细胞数量较UVB组明显减少,提示转染miR-23a mimics预处理可明显抑制S期阻滞发生;同时UVB照射后24小时,HaCaT细胞凋亡率升高至12.94%,说明UVB照射可诱导HaCaT细胞凋亡,而miR-23a mimics+UVB组的细胞凋亡率为仅1.46%,相对单纯UVB照射组明显减少,提示过表达miR-23a可抑制UVB照射引起的细胞凋亡; 3过表达miR-23a加速HaCaT细胞中UVB照射所致光产物CPDs的清除 HaCaT细胞经30mJ/cm2 UVB照射后,细胞核内立刻开始产生CPDs,在UVB照射后的各个观测时点(0、2、6和8小时),免疫荧光法和免疫印迹法结果均显示miR-23a mimics+UVB组HaCaT细胞核内CPDs的清除速度较单纯UVB照射组快,提示过表达miR-23a可加速HaCaT细胞中UVB照射所致光产物的清除; 4关于miR-23a的生物信息学分析经在线数据库及基因本体论预测分析显示miR-23a排在前五位的预测靶位点是FUT9、ETNK1、RAB39B、KIAA1467和TOP1,它们主要与信号转导、DNA复制、物质代谢以及核苷酸代谢有关。Top1被预测是miR-23a调控的保守靶位点之一,经文献检索发现其在DNA修复中发挥一定作用; 5过表达miR-23a降低Top1报告基因的荧光素酶活性在双荧光素酶报告基因实验中,miR-23a mimics和野生型双荧光素酶重组质粒共转染293T细胞后,Top1报告基因的荧光素酶活性较阴性转染组降低,仅为阴性转染组的45%,说明miR-23a可通过与Top1 3’UTR特异性结合降低报告基因的荧光素酶活性; 6过表达miR-23a降低UVB照射后Top1蛋白的表达 UVB照射后Top1蛋白表达增加,而miR-23a mimics+UVB组Top1蛋白的表达低于单纯UVB照射组,提示转染miR-23a mimics预处理可抑制UVB诱导的Top1蛋白表达增加。结论: 过表达miR-23a可减轻UVB诱导的细胞生长抑制、细胞凋亡及细胞周期阻滞,并加速光产物CPDs的清除。与DNA损伤修复有关的Top1是miR-23a调控的靶基因之一,miR-23a通过调控Top1的表达发挥抗紫外线光损伤作用。miR-23a可能成为治疗皮肤光源性损伤及光源性皮肤病的新靶点。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011
【分类号】：R739.5

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