P16蛋白在人毛乳头细胞中的表达及对其生长特性的影响

发布时间：2018-06-04 09:33

  本文选题：毛乳头细胞 + P16　； 参考：《河北医科大学》2012年硕士论文

【摘要】：目的：毛囊是毛发的主体，是一个典型的再生系统，而毛乳头细胞在毛囊发育和毛囊周期调控中起主导作用。毛乳头细胞是一种特化的成纤维细胞，诱导毛囊形成是毛乳头细胞最为显著的功能特征，但是体外培养的毛乳头细胞只有形成凝集性生长后才具有诱导毛囊形成的能力。随着传代次数的增加，毛乳头细胞的凝集性生长特性逐渐减弱。 P16基因是一种定位于9p21的多种肿瘤抑制基因，主要有以下几种名称：INK4a、CDK4I、CDKN2、MST-1，，其中以INK4a最常见，基因产物P16蛋白属细胞周期蛋白依赖激酶抑制剂家族，可对细胞周期起到反向调节作用，使细胞生长到一定时期后丧失其生物学特性，出现凋亡反应，遏制细胞的过度增殖，阻止肿瘤的形成。P16蛋白还参与其它程序的调控，例如衰老、侵入、血管及红细胞的生成和HPV感染等。有研究表明P16蛋白在衰老的成纤维细胞中呈过度表达，其对成纤维细胞的衰老有一定的促进作用，而毛乳头细胞作为一种特化的成纤维细胞，其P16蛋白的表达情况目前尚未见报道。本实验拟研究P16蛋白在毛乳头细胞中的表达情况，揭示体外培养的人毛乳头细胞发生衰老的可能机制，研究外源性的P16蛋白对毛乳头细胞的影响，为以后临床毛发疾病的治疗提供实验依据。 方法： 1毛乳头细胞的分离、培养。将改良二步酶消化法获得的毛乳头通过差速离心的方法收集，移入装有DMEM培养基（15%胎牛，1%双抗）的培养瓶中，温箱（5%CO2，37℃）内常规培养。 2毛乳头细胞的鉴定、传代。通过α-平滑肌肌动蛋白染色鉴定毛乳头细胞。待细胞融合至70%-80%时用胰蛋白酶（0.25%）消化传代，放置温箱内常规培养。 3应用免疫组化S-P法检测不同传代次数的毛乳头细胞P16蛋白的表达情况。 4应用流式细胞术检测不同传代次数的毛乳头细胞P16蛋白的表达情况。 5MTT分析法检测不同浓度的重组人P16蛋白(5ng/ml～200ng/ml)对处于对数生长的人毛乳头细胞衰老的影响。 6应用统计软件SPSS13.0，采用单因素方差分析，以α=0.05的检验标准对数据进行统计分析及处理。 结果： 1应用“二步酶消化法”和“差速离心法”，成功分离提取出较纯的毛乳头，贴壁迅速，可见凝集性生长的特性，3-5代最显著，7-8代以后完全消失。 2毛乳头细胞经过α-SMA（α-平滑肌肌动蛋白）免疫组化染色后，在倒置显微镜下可见细胞胞浆中含有大量细丝状的α-平滑肌肌动蛋白。 3免疫组化S-P法检测4代、8代细胞中P16蛋白的表达情况。在倒置显微镜下可见4代细胞和8代细胞胞核P16蛋白表达分别为极弱阳性和弱阳性（±），均伴有胞浆弱阳性表达（±），两组之间有差异。空白对照组细胞胞核胞浆均为阴性表达（-）。 4流式细胞术检测4代、8代细胞中P16蛋白的表达情况。P16蛋白的表达量用均道值表示。流式结果显示，4代、8代毛乳头细胞及阴性对照组中P16蛋白表达的均道值分别为-49.32±4.20、-47.38±12.99、-71.51±19.19，蛋白表达量为负值，统计分析显示各组间均无显著性差异(P0.05)。 5MTT检测外源性P16蛋白对毛乳头细胞衰老的影响。取5代处于对数生长期的细胞加入不同浓度的重组人P16，培养72h后，倒置显微镜下观察细胞形态，未见明显变化。MTT结果显示，各实验组与阴性对照组相比，在5ng/ml-25ng/ml浓度内，促衰老作用呈现剂量依赖性，统计分析有显著性差异（P0.05），再增加细胞因子浓度，促衰老作用反而减弱。 结论： 1二步酶消化法可快速有效的提取较纯的毛乳头。随着传代次数的增加，毛乳头细胞的凝集性生长的特性逐渐消失。 2体外培养时，毛乳头细胞中P16蛋白含量极低，随着传代次数的增加，人毛乳头细胞中P16蛋白的表达量逐渐增加，提示在毛乳头细胞的衰老过程中，P16可能发挥着较为重要的作用。这也间接证实了毛乳头细胞是一簇特化的成纤维细胞的观点。 3外源性的P16蛋白对毛乳头细胞的衰老有促进作用，也间接验证了P16可能在毛乳头细胞的衰老中发挥着重要的作用。
[Abstract]:Objective: hair follicle is the main body of hair and is a typical regeneration system, and dermal papilla cells play a leading role in hair follicle development and hair follicle cycle regulation. Hair papilla cells are a special fibroblast, inducing hair follicle formation is the most significant function characteristic of dermal papilla cells, but the cultured dermal papilla cells are only formed in vitro. The ability to induce hair follicle formation was only observed after agglutination. With the increase of passage times, the agglutination growth characteristics of dermal papilla cells gradually weakened.
The P16 gene is a variety of tumor suppressor genes located in 9p21, which mainly include the following names: INK4a, CDK4I, CDKN2, MST-1, which are most common in INK4a. The gene product P16 protein belongs to the cyclin dependent kinase inhibitor family, which can reverse the cell cycle and cause the cell to lose its organism after a certain period of time. Some studies suggest that P16 protein is expressed in senescent fibroblasts, and that P16 protein is expressed in senescent fibroblasts, and has a certain promotion of senescence in fibroblasts. The expression of P16 protein in dermal papilla cells, as a special fibroblast, has not yet been reported. This experiment is to study the expression of P16 protein in dermal papilla cells, to reveal the possible mechanism of aging of human dermal papilla cells in vitro, and to study the effect of exogenous P16 protein on dermal papilla cells. To provide experimental evidence for the treatment of clinical hair diseases.
Method锛

本文编号：1976881