RNAi技术抑制恶性黑色素瘤细胞Ang2基因表达

发布时间：2018-08-07 18:41

【摘要】：目的: 构建并鉴定Ang2基因的RNA干扰慢病毒表达载体,观察其对恶性黑色素瘤细胞Ang2基因的干扰作用,为将来进一步进行裸鼠恶性黑色素瘤移植瘤生长的抑制实验奠定基础,为肿瘤的基因治疗提供实验依据。 方法: 1、将重组质粒pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA用限制性内切酶XbaⅠ酶切成所需要的目的片段U6-Ang2-siRNA,经电泳鉴定后,与经限制性内切酶XbaⅠ酶切电泳鉴定的pNL-EGFP载体连接,构建pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ慢病毒转移质粒,电泳筛选阳性单克隆,测序鉴定。 2、将连接成功的慢病毒转移质粒pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ,分别与包装质粒pHelper和包膜质粒pVSVG组成慢病毒三质粒转染系统[1、2],再共转染293T细胞,生产pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ慢病毒。 3、将收集的慢病毒上清按不同的浓度感染293T细胞,测定病毒原液的滴度。 4、将收集的病毒原液按不同的感染复数感染感染恶性黑色素瘤细胞,确定合适的感染复数。 5、在合适的感染复数的条件下,将收集的慢病毒感染恶性黑色素瘤细胞,通过实时荧光定量RT-PCR方法检测恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因的表达量,进而得到RNAi沉默Ang2基因表达的效率。 结果: 1、酶切电泳表明限制性内切酶XbaⅠ成功的从重组质粒pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA中酶切出所需要的目的片段U6-Ang2-siRNA。 2、酶切电泳表明限制性内切酶XbaⅠ成功酶切pNL-EGFP载体。 3、经限制性内切酶XbaⅠ酶切后电泳鉴定及测序鉴定证实成功构建了慢病毒转移质粒pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ。 4、利用三质粒慢病毒转染系统成功的构建了pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ慢病毒,收集慢病毒上清,并测得慢病毒滴度为8.0x103/ul。 5、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ、pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ慢病毒感染恶性黑色素瘤细胞,感染效率较高达94.6%,实时荧光定量RT-PCR的结果显示:pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅰ慢病毒载体抑制了恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因的表达,抑制率为68.31%(P0.05),pNL-EGFP-U6-Ang2-Ⅱ慢病毒抑制恶性黑色素瘤细胞中Ang2基因的表达效率低,抑制率为13.31%,且差异无统计学意义(P0.05)。 结论:成功的利用三质粒转染系统构建了Ang2-SiRNA慢病毒载体,利用Ang2-SiRNA慢病毒载体体外感染恶性黑色素瘤细胞,感染效率较高,且能抑制恶性黑色素瘤细胞的Ang2 mRNA的表达,为下一步进行裸鼠恶性黑色素瘤移植瘤生长的抑制实验奠定基础,为肿瘤的基因治疗提供实验依据。
[Abstract]:Objective: to construct and identify the RNA interfering lentivirus expression vector of Ang2 gene and observe its interfering effect on Ang2 gene in malignant melanoma cells. It will lay a foundation for the further growth inhibition of malignant melanoma in nude mice and provide experimental basis for gene therapy of tumor. Methods: 1. The recombinant plasmid pSilencer 1.0-U6-Ang2-siRNA was digested with restriction endonuclease Xba 鈪，

本文编号：2170996