胎盘间充质干细胞对小鼠特应性皮炎样模型的影响及机制探讨

发布时间：2016-12-25 16:32

  本文关键词：胎盘间充质干细胞对小鼠特应性皮炎样模型的影响及机制探讨，由笔耕文化传播整理发布。

《苏州大学》 2014年

胎盘间充质干细胞对小鼠特应性皮炎样模型的影响及机制探讨

余珊珊  

【摘要】：目的：(1)分离培养人胎盘间充质干细胞(placenta mesenchymal stem cells，PMSCs)备用；(2)建立特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)样动物模型；(3)探讨PMSCs对小鼠AD样皮损的影响；(4)探讨PMSCs对AD样动物模型引流淋巴结和脾脏中Foxp3+Treg数量的影响；(5)PMSCs在小鼠AD样模型中对皮损IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF、IFN-γ的影响及机制。 方法：(1)PMSCs分离用组织块法联合酶消化法，鉴定采用流式细胞仪检测细胞表面分子，体外诱导其分化成脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞；(2)用1%5-异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate，FITC)诱发BALB/c小鼠建立急性(激发1次)和慢性(每3d激发1次，共7次)AD样模型；(3)静脉注射不同剂量的PMSCs(0.5×106，1×106或2×106个/次/只)治疗小鼠急(1次)、慢性(2次)AD样模型，肉眼观察小鼠耳朵和背部皮肤的变化，动态测量小鼠耳厚度，处死前称重，处死后称其耳和脾脏重量，计算左右耳的重量差以及脾脏指数；(4)用流式细胞术检测小鼠脾脏及耳部引流淋巴结的Foxp3+Treg细胞；(5)用流式细胞仪微球捕获芯片技术法(CBA)检测小鼠背部皮肤组织匀浆中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF、IFN-γ含量；(6)小鼠耳朵和背部皮肤进行常规组织病理切片和HE染色，光镜下观察其皮肤病理改变，并计算表皮层数和真皮中的炎症细胞数。 结果： （一）成功分离、鉴定、扩增PMSCs PMSCs表面表达CD29、CD90、CD105，CD34、CD45、HLA-DR为阴性，PMSCs体外诱导可分化为成脂肪细胞、成骨细胞和成软骨细胞。 （二）成功建立小鼠AD样模型 (1)急性AD样模型激发前左耳厚度(24.90±0.89)×10-3mm，激发12h后耳廓和背部皮肤可见轻度水肿性红斑，24h后厚度达到(28.00±1.06)×10-3mm，48h时达高峰(28.70±0.67)×10-3mm，此时左耳重量为(13.88±0.61)mg，左右耳的重量差为(0.84±0.72)mg。耳和背部皮肤的组织病理变化类似急性皮炎，表现为表皮轻微水肿和增厚，真皮浅层水肿，小血管扩张，较多的炎症细胞浸润(主要是单一核细胞和少许多形核细胞)，与基质组比较，耳和背部的浸润细胞数增多(P0.05)、背部的表皮层数增多(P0.05)。模型组小鼠皮损中Th1、Th2细胞因子均升高，IFN-γ/IL-4比值比基质组下降，此小鼠中出现以Th2占优势的Thl/Th2的平衡失调。 (2)慢性AD样模型第1次激发前左耳厚度(27.00±1.27)×10-3mm，第1次激发12h后即出现轻度水肿性红斑，随着激发次数的增多，水肿性红斑逐渐加重，并可见渗出结痂、鳞屑和毛发脱落(主要见于背部)，，第28d(处死前)耳厚度为(39.30±4.15)×10-3mm，左耳重量为(19.60±3.86)mg，左右耳的重量差为(5.24±3.26)mg。光镜下皮肤呈亚急性和慢性皮炎样改变：耳部皮肤可见表皮角质层较明显增厚，偶见血清痂，棘层增厚(4～5层)，真皮内有大量的细胞浸润(主要是单一核细胞和少许多形核细胞)；背部皮肤表现为表皮显著角化过度，角化不全，棘层明显增厚(6～8层)，有细胞外移，偶见血清痂，真皮内有大量炎症细胞浸润(主要是单一核细胞)，与基质组相比，浸润细胞数和棘层层数均明显增多(P0.05~0.01)。模型组小鼠皮损中IFN-γ/IL-4比值仍低于基质组，Th2占优势的Thl/Th2的平衡失调依然存在。 （三）PMSCs对小鼠AD样模型的影响 (1)急性小鼠AD样模型激发后24h时，PMSCs注射的高剂量组小鼠耳厚低于模型组(P0.05)，中剂量组亦小于模型组，但差异无显著性(P＞0.05)，48h时，中、高剂量组的耳厚度小于模型组(P0.05)。其效果与剂量呈正相关；PMSCs中、高剂量组的耳重量小于模型组，但无统计学意义(P0.05)。在组织病理片上，中、高剂量组耳和背部皮肤中的真皮浸润细胞数和背部表皮的层数均低于模型组(P均0.05)，表明PMSCs对急性AD样皮损有治疗作用； (2)慢性小鼠AD样模型PMSCs高剂量组在激发1d后与模型组相比耳厚度小于模型组(P0.05)，在4d后中、高剂量组耳的厚度均小于模型组(P0.05)，且高剂量的疗效好于低剂量组；PMSCs各剂量组耳重量均轻于模型组，但无显著性差异(P0.05)。组织病理学方面，高剂量组的耳和背部皮肤真皮中浸润细胞数以及背部的表皮厚度小于模型组(P0.05)，中剂量组的浸润细胞数亦低于模型组(P0.05)；此外，高剂量组真皮内的浸润细胞数和背部表皮的厚度小于中剂量组(P均0.05)，说明PMSCs对慢性小鼠AD样皮损亦有治疗作用，且其疗效与细胞浓度有关。 (四)PMSCs对小鼠AD样模型中Foxp3+Treg细胞数量的影响 中、高剂量PMSCs可促进AD样小鼠急性期引流淋巴结中Foxp3+Treg的生成，对脾脏中Foxp3+Treg细胞数未见明显影响。 (五)各组小鼠皮损中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-17A、TNF和IFN-γ的变化 (1)与急性基质对照组相比，急性模型组皮损中Th2型细胞因子IL-4、IL-6、IL-10水平显著升高，Th1型细胞因子IL-2升高、IFN-γ无明显变化，炎性因子TNF显著升高，Th17细胞特异性标志IL-17A显著升高(P0.05)，模型组IFN-γ/IL-4(1.32±0.76)低于基质组(2.11±0.86)，提示该模型是由Th2型免疫反应所致。 (2)与慢性基质对照组相比，慢性模型组皮损中Th2型细胞因子IL-4、IL-6、IL-10水平升高，Th1型细胞因子IFN-γ轻度升高、IL-2无明显变化，炎性因子TNF显著升高，Th17细胞特异性标志IL-17A无明显改变，慢性组IFN-γ/IL-4(0.73±0.64)小于基质组(1.34±0.41)，提示该慢性模型组亦是以Th2型免疫反应为主。 (3)地塞米松对小鼠AD样模型治疗的作用机制 地塞米松可显著抑制急性小鼠AD样模型皮损中IL-2、IL-4水平，轻微减少TNF、IFN-γ的产生，对IL-6、IL-10无明显影响，使IFN-γ/IL-4(2.76±3.53)升高，使皮损中的炎性因子TNF减少以及IL-17A下降，表明地塞米松可以通过调控Th1/Th2细胞的失衡来减轻皮损炎症。 (4)PMSCs对小鼠AD样模型治疗的作用机制 ①与急性模型组比较，低、中剂量PMSCs引起小鼠急性AD样模型皮肤中Th2细胞因子IL-6、IL-10明显下降，中剂量组中IL-4下降，低剂量组中IL-4无明显改变，而高剂量组致使皮损中的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、IL-17A升高；使低、中剂量组的IFN-γ/IL-4(0.86±0.28、0.97±0.22)减少，高剂量组的(2.12±1.55)升高，并趋于正常，提示PMSCs对Th1、Th2、Th17的影响随着浓度的高低可能具有双向调节作用，且与细胞浓度相关。 ②与慢性模型组比较，PMSCs可使皮损中的IL-10和TNF减少，但对其他因子无明显影响。 结论： (1)成功分离PMSCs； (2)用1%FITC诱导BALB/c小鼠成功建立以Th2型免疫反应为主的急、慢性AD样模型； (3)静脉给予PMSCs可减轻小鼠急、慢性AD样皮肤炎症，且疗效与剂量有关，其机制可能是通过调控Th1/Th2、Treg/Th17细胞失衡发挥治疗作用。

【关键词】：
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R758.2
【目录】：

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