【摘要】：研究背景及目的黑色素瘤是发生在皮肤组织的一种恶性肿瘤，黑色素瘤[LU1]对人类健康的危害性不断增长[LU2]，在已发现[LU3]发生转移的黑色素瘤患者中，平均存活时间只有6到10个月。发生转移的黑色素瘤细胞具有非常[LU4]强大的增殖能力，并且对大多数的[LU5]肿瘤治疗药物均具有明显的抗性[LU6]作用，因此导致对其的[LU7]治疗效果非常不理想。这些治疗方案包括多种已用于三期临床试验的方法，例如免疫治疗，细胞因子治疗，放射治疗以及化学治疗等。甚至是化学治[LU8]疗试剂的联合使用[LU9]疗法在过去的20年中也没有改变临床试验的生存率问题。 研究表明黑色素瘤对治疗药物的超强抵抗性作用和主要是与其自身多种细胞凋亡通路发生失活有关。研究表明这些治疗方案包括多种已用于三期临床试验的方法，例如免疫治疗，细胞因子治疗，放射治疗以及化学治疗。甚至是化学治疗试剂的联合使用疗法在过去的20年中也没有改变临床试验的生存率问题。 黑色素瘤细胞对于药物治疗的高度耐受，因为黑色素瘤细胞[LU10]能够很好地适应治疗药物形成的内质网应激，并逃脱由其内质网应激[LU11]导致的凋亡，从而表现为高度耐受药物治疗。因此，研究黑色素瘤对于内质网应激的适应机制显得尤为重要。传统的治疗方法不能改善黑色素瘤的生存率问题，究其根本原因是人们对黑色素瘤中[LU12]细胞凋亡的具体机制缺乏了解，很多特异性的存活机制导致常规药物治疗完全失去效应。同时，近年来的报道也证明黑色素瘤具有很强的生存机制并参与了黑色素瘤对化疗药物的抵抗作用，。因此，研究黑色素瘤对于内质网应激的适应机制显得尤为重要。近年来的报道也证明了越来越多的生存机制参与了黑色素瘤对药物的抗性作用中，关于这方面的研究也越来越受到人们的关注。在此基础上，本项工作旨在研究黑色素瘤细胞在内质网应激条件下的存活机制及其具体的信号通路，我们期望找到能够成为黑色素瘤治疗过程中有效的生物标志物的蛋白[LU13]，以期为黑色素瘤的临床治疗提供新的思路和药物作用靶点。 方法（1）以黑色素瘤细胞Mel-RM为研究对象，用衣霉素(TM)处理构建内质网应激的模型，，以对于内质网应激具有抗性的黑色素瘤细胞Mel-RM为研究对象，用衣霉素(TM)处理细胞，构建内质网应激的模型，然后通过mRNA芯片分析，寻找到对于内质网应激具有抗性的黑色素瘤细胞差异基因的表达基因survivin[LU14]；并采用QRT-PCR、Western Bloting验证芯片结果，（2）根据芯片分析结果，同时检测比较内质网应激情况下不同黑色素瘤细胞株中survivin的表达情况以及其他种类肿瘤中survivin的表达；（2）；并利用慢病毒系统筛选到survivin稳定过[LU15]表达的Mel-RM细胞株，采用衣霉素处理后，利用Hoechst33342染核、MTT法分析细胞活力、Western Bloting检测细胞凋亡的分子标志物等方法，来比较检测survivin过表达的情况下黑色素瘤细胞对于内质网应激诱导凋亡抗性的变化情况；（3）黑色素瘤细胞在内质网应激时细胞周期阻滞于G1期，过表达survivin后通过流式细胞术检测细胞周期的变化情况、及Western Bloting分别检测细胞周期及检测细胞周期相关蛋白的变化水平，观察在内质网应激时，过表达survivin的黑色素瘤细胞的细胞周期变化情况；（4）采用生物信息学方法分析survivin的启动子区域结构及，发现潜在的转录因子E2F1的结合位点。通过荧光素酶实验证实survivin的启动子活性在内质网应激时被抑制，但外源实验证实能够被E2F1激活，采用RNA干扰方法降低E2F1的蛋白水平后survivin的变化消失。 结果（1）对于内质网应激具有抗性的黑色素瘤细胞在衣霉素处理时survivin的mRNA和蛋白水平下调，而且这种改变是黑色素瘤细胞所特有；（2）survivin的下调与黑色素瘤对于内质网应激的抗性相关，而且外源过表达survivin后降低了黑色素瘤细胞对于内质网应激的抗性；（3）survivin的下调是通过形成细胞周期阻滞来保护黑色素瘤细胞，从而表现为适应内质网应激；外源过表达survivin后，促进黑色素瘤细胞通过G1期阻滞，从而减弱黑色素瘤细胞对于内质网应激的抗性；（4）survivin在内质网应激情况下受E2F1转录调控。E2F1蛋白水平在内质网应激时降低，从而减弱对于survivin的转录调控。外源过表达E2F1同样降低黑色素瘤细胞对于内质网应激的抗性。 结论研究发现survivin的下调对于黑色素瘤细胞逃脱内质网应激引起的凋亡至关重要，稳定过表达survivin的黑色素瘤细胞株对于内质网应激的敏感性明显增加。Survivin下调使黑色素瘤细胞能够很好适应内质网应激的具体机制是通过形成细胞周期阻滞实现的。而且我们发现内质网应激的情况下survivin受转录因子E2F1转录调控，稳定过表达野生型的E2F1同样明显增加黑色素瘤细胞对于内质网应激的敏感性。我们的研究结果证实了黑色素瘤细胞耐受内质网应激的机制中存在E2F1-survivin-cell cycle arrest这样一条信号通路。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R739.5
【共引文献】
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