三氧化二砷联合干扰素对人黑色素瘤细胞A375作用及其机制研究

发布时间：2018-10-17 12:40

【摘要】： 目的:恶性黑素瘤(malignant melanoma,MM)是一种严重威胁人类生命的肿瘤,占皮肤恶性肿瘤的第三位。其恶性程度高侵袭力极强,且多发、易转移,患者的5年生存率极低。目前虽然外科手术仍是治疗恶性黑素瘤的首选方法,但是即使外科手术切除,预后仍然较差。化疗效果亦不佳,有效率低于25%。因此,寻求有效的药物治疗成为恶性黑素瘤治疗领域的研究热点。三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)为中药雌黄的主要成份。三氧化二砷用于慢性粒细胞性白血病和急性早幼粒细胞性白血病已取得良好的疗效,其诱导恶性淋巴瘤、食管癌、肝癌、胰腺癌、胃癌和肺癌等细胞株凋亡的研究也有报道,但As2O3对恶性黑素瘤相关研究报道很少。大量体外实验表明三氧化二砷可能通过诱导细胞分化、阻滞细胞周期、抗肿瘤血管生成及调节多种基因表达及诱导肿瘤细胞凋亡而发挥其抗肿瘤作用。其作用机理尚不明确,As2O3是否能用于恶性黑色素瘤的临床治疗,有待进一步研究。干扰素具有抗肿瘤和免疫调节作用,三氧化二砷和干扰素分别属于外源性和内源性的分化诱导剂,二者联合应用,有可能提高肿瘤对诱导剂的敏感性,增强抗肿瘤作用,从而降低单药剂量,减少毒副作用,从而提高治疗效果。这在皮肤恶性黑素瘤方面的研究未见报道。 PPO (proliferation and phosphorylation oncogene)基因是一个新的癌基因。它定位于人类1号染色体末端1p36.13区,DNA长度约36000bp,cDNA长度6022bp。共有25个外显子,编码993个氨基酸。研究显示该基因在多种恶性肿瘤癌组织及细胞株中都有过表达,与细胞增殖关系密切,且该基因所产生的蛋白位于细胞质内,能够使MAPK通路中的MEK1/2和ERK2磷酸化,MAPK通路是癌症发生的重要通路,因而该基因与多种癌症的形成有密切关系。三氧化二砷及干扰素抗皮肤恶性黑素瘤的机制尚未完全阐明。本研究采用恶性黑色素瘤人A375细胞作为工作模型,探讨三氧化二砷、干扰素在不同浓度、不同作用时间对皮肤黑色素瘤细胞增殖抑制作用及形态分化的影响,筛选两药联合应用的最佳作用时间和剂量;探讨两药联合应用对人A375细胞表达的癌基因PPO的影响。为干扰素、三氧化二砷类药物诱导皮肤肿瘤细胞凋亡的基础研究及恶性黑色素瘤的治疗提供新的理论和实验依据。方法: 1细胞培养将A375细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基(含青霉素100U/ml,含链霉素100U/ml,PH7.2)中,置于37℃、饱和湿度、5%CO2的培养箱内常规传代培养。 2 MTT比色分析法检测三氧化二砷和干扰素对人A375细胞增殖抑制的影响。 2.1不同浓度三氧化二砷(1μmol/L5μmol/L10μmol/L)分别作用244872小时后对A375细胞增殖的影响。 2.2不同浓度干扰素(0.5万u/ml1万u/ml2万u/ml)分别作用244872小时后对A375细胞增殖的影响。 2.3联合应用5.0μmol/L三氧化二砷和1万u/ml干扰素作用48小时后对A375细胞增殖的影响,采用金氏公式分析相互作用指数(q),评价联合后的效应。 3倒置相差显微镜观察各组药物处理后对人A375细胞的细胞分化及形态的影响。 4采用流式细胞分析术,检测人A375细胞的细胞周期变化和凋亡的发生,将实验分为4组,分别为阴性对照组(不加任何药物)三氧化二砷组(5.0μmol/L)干扰素组(1万u/ml)三氧化二砷(5.0μmol/L)联合干扰素组(1万u/ml)。各组药物干预48小时后,收集各组别细胞,用流式细胞仪检测细胞凋亡及周期分布情况。 5应用免疫细胞化学s-p法检测各组药物处理后人A375细胞PPO蛋白的表达情况。 6运用统计软件SPSS13.0对数据进行统计处理,采用单因素方差分析,以a=0.05为差异显著性标准。结果: 1未经药物处理过的人A375细胞呈梭形或多角形,贴壁生长,分布均匀,大小基本一致,增殖旺盛,核固缩现象少见。 2 MTT比色分析法检测处理因素对人A375细胞增殖的影响(相对抑制率)。 2.1三氧化二砷组各组间差别具有显著性(p0.05)。不同浓度的三氧化二砷对人A375细胞的抑制作用呈现明显的剂量依赖效应关系和时间依赖效应关系。 2.2干扰素组各组间差别具有显著性(p0.05)。不同浓度的干扰素对人A375细胞的抑制作用呈现较明显的剂量依赖效应和时间依赖效应关系。 2.3三氧化二砷联合干扰素组将实验分为4组,分别为阴性对照组(不加任何药物)三氧化二砷组(5.0μmol/L)干扰素组(1万u/ml)三氧化二砷(5.0μmol/L)联合干扰素组(1万u/ml)。三氧化二砷和干扰素联合应用可抑制A375细胞增殖,与三氧化二砷或干扰素单独应用比较,差异有显著性(p0.05)。金氏公式分析表明三氧化二砷与干扰素联合应用对A375细胞有协同的抑制作用。 3三氧化二砷及干扰素对A375细胞分化及形态的影响阴性对照组细胞呈梭形或多角形,贴壁生长,分布均匀,大小基本一致,增殖旺盛,核固缩现象少见;三氧化二砷作用细胞24小时后,人A375出现生长不佳,细胞变狭长,皱缩破裂,有的细胞两端出现伪足,飘浮细胞增多,一些细胞呈双极性改变等现象,随着三氧化二砷作用时间的延长,上述现象更加明显;干扰素作用后一些细胞呈双极性改变,脱壁悬浮细胞增多,随着作用时间延长,上述现象更加明显;两者联合应用组细胞生长缓慢,细胞数目明显减少,脱壁悬浮细胞明显增多,未脱壁中细胞双极性改变相对增多。 4流式细胞仪检测各组药物处理后细胞的凋亡情况和细胞周期变化各组药物均能使S期延滞,与对照组相比G0/G1的细胞逐渐减少(P0.05),并提高S期细胞比例。表明各组药物的抑制作用与细胞周期的细胞数百分比变化有关。S/G2转化抑制,将细胞阻滞于S期,使S期细胞的比率增加。三氧化二砷与联合干扰素应用对细胞周期的影响具有协同作用,流式检测细胞凋亡结果表明干扰素诱导A375细胞凋亡的作用并不明显,但三氧化二砷诱导A375细胞凋亡的作用显著。 5免疫细胞化学法检测干扰素及三氧化二砷诱导前后对人A375细胞PPO表达情况 PPO蛋白主要表达于细胞浆内,DAB染色呈棕黄色。各组细胞PPO蛋白阳性表达的程度不同,阴性对照组细胞PPO表达较强,呈深棕黄色;在三氧化二砷组干扰素组及联合用药组A375细胞中,PPO的染色程度均有不同程度的减弱,差异具有显著性(p0.05)。结论: 1三氧化二砷和干扰素均对人A375恶性黑色素瘤细胞有增殖抑制,在一定浓度范围内其抑制效能与药物浓度有关;在一定时间范围内随时间延长,三氧化二砷和干扰素均对人A375细胞的增殖的抑制作用增强,抑制效能有时间依赖性; 2三氧化二砷及干扰素作用于A375细胞时,随着药物浓度的增加,S期的比例均显著增加,出现S期阻滞,提示三氧化二砷及干扰素将A375细胞阻滞在S期可能是其增殖抑制的原因之一。 3三氧化二砷联合干扰素应用对人A375细胞有协同诱导作用,可有效抑制人A375细胞的生长。三氧化二砷和干扰素联合应用对人A375黑色素瘤细胞的抑制作用可能与下调癌基因PPO的表达有关,这可能是其抗肿瘤机制之一。具体机制有待于进一步深入研究。 4三氧化二砷诱导人A375细胞凋亡显著,虽未观察到干扰素组的凋亡现象,但并不能排除干扰素对人A375细胞的作用与凋亡无关。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2010
【分类号】：R739.5

【参考文献】