PAI-1-RNAi对SD大鼠皮肤成纤维细胞增殖的影响

发布时间：2018-10-19 16:08

【摘要】：目的:本实验探讨应用RNA干扰(RNA Interference,RNAi)技术下调纤溶酶原激活抑制剂-1(Plasminogen Activator Inhibitor-1,PAI-1)表达对SD大鼠皮肤成纤维细胞(fibroblast)增殖的影响,通过体外实验从细胞水平探究PAI-1对成纤维细胞增殖、转化的作用,进一步为前期动物实验PAI-1 siRNA可改善SD大鼠瘢痕疙瘩模型提供理论依据,为瘢痕疙瘩(keloid)基因治疗开辟新思路。方法:1 SD大鼠皮肤成纤维细胞培养采用组织块培养法获取原代SD大鼠皮肤成纤维细胞,经传代培养去除上皮细胞、红细胞等杂质成分,获取单一成纤维细胞,倒置显微镜下观察细胞生长及形态变化。2免疫细胞化学法鉴定细胞应用免疫细胞化学法,通过检测波形蛋白表达是否阳性,鉴定所培养的细胞是否为成纤维细胞。3 PAI-1 siRNA转染至体外培养的成纤维细胞,并进行实验分组利用脂质体(Lipofectamine 2000)转染siRNA至体外培养传代至第六代的成纤维细胞,根据转染不同设置实验分组为:转染PAI-1 siRNA的实验组、转染NC siRNA的阴性对照组、不进行转染的空白对照组。4应用RT-PCR法检测转染24小时,PAI-1 m RNA、TGF-β1 m RNA的表达。5应用Western blot法测定转染48小时,PAI-1、AKT、ERK、p-AKT、p-ERK蛋白的表达。6应用台盼蓝染色法计数细胞并绘制曲线。分别于转染24小时、48小时、72小时,制备细胞悬液进行台盼蓝染色,镜下计数细胞总数以及未被染液染色的细胞总数(或被染色的细胞总数),以培养时间为横坐标,细胞计数为纵坐标,绘制成纤维细胞生长曲线及成纤维细胞成活率曲线。7应用CCK-8测定成纤维细胞的增殖活力绘制曲线。分别于转染24小时、48小时、72小时加入CCK-8试剂,孵育4小时后,通过使用酶联免疫检测仪测定吸光度(OD值),根据计算公式,得出细胞的OD值、细胞增殖抑制百分率(%)。以培养时间为横坐标,细胞的OD值为纵坐标绘制生长曲线;以培养时间为横坐标,细胞增殖抑制百分率(%)为纵坐标绘制增殖抑制率曲线。8统计学处理本实验所有数据应用SPSS 21.0统计软件,实验数据为计量资料,采用均数±标准差表示,统计结果以P0.05认为差异有统计学意义。进行数据分析之前,先分析数据的正态性和方差齐性。若数据服从正态性分布且方差齐时,则多样本比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),组间比较采用SNK-q检验;若不服从正态性分布或方差不齐,则选用秩和检验中的Kruskal-Wallis H检验,组间比较采用Mann-Whitney U检验。结果:1采用组织块培养法成功获取SD大鼠皮肤成纤维细胞,经传代至第5-6代可获取单一成分的成纤维细胞;2采用免疫细胞化学法染色检测波形蛋白,镜下可见培养细胞胞浆显示棕色或棕黄色颗粒,细胞核未见着色,即波形蛋白抗体染色阳性,证实实验所培养细胞是成纤维细胞;3应用Real time PCR检测PAI-1成功转染成纤维细胞,成纤维细胞中PAI-1 m RNA、TGF-β1 m RNA表达明显降低,三组间RQ值总体均数不同或不全相同(P0.05),实验组与阴性对照组间、实验组与空白对照组间差异有统计学意义(P0.05),而阴性对照与空白组间无统计学意义(P0.05);4应用Western blot检测成功转染PAI-1 siRNA,成纤维细胞中PAI-1、p-AKT、p-ERK蛋白的表达明显下调,实验组与阴性对照组间、实验组与空白对照组间差异有统计学意义(P0.05),而阴性对照与空白组间无统计学意义(P0.05);而对去磷酸化状态AKT、ERK无影响,三组之间差异无统计学意义(P0.05);5台盼蓝染色后计数细胞,绘制成纤维细胞生长曲线及成活率曲线可见随着时间进展转染PAI-1 siRNA后成纤维细胞数量增长速度较阴性对照组与空白对照组明显减慢,细胞成活率显著降低;6采用CCK-8试剂测定绘制成纤维细胞生长曲线及成纤维细胞增殖抑制率曲线,观察走势,与对照组相比可见转染PAI-1 siRNA后的成纤维细胞增殖活力低,增殖抑制率较高。结论:本实验研究成功获取原代SD大鼠皮肤成纤维细胞,选取传代至第五或第六代细胞,转染PAI-1 siRNA,经一系列实验得出干扰PAI-1表达可抑制SD大鼠皮肤成纤维细胞增殖、转化,抑制TGF-β1表达,抑制AKT、ERK信号途径,从而表现为成纤维细胞增殖速度减慢,增殖活力降低,成活率降低。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R751

【参考文献】