扇贝多肽经由P16和RASSF1A基因甲基化抑制UVB诱导的HaCaT细胞恶性转化

发布时间：2018-10-19 17:06

【摘要】：目的建立模拟日光紫外线B辐射诱导的HaCaT细胞恶性转化的病理模型,从Gadd45a、DNMTs、P16和RASSF1A基因甲基化的角度,研究扇贝多肽(PCF)抑制UVB诱导的HaCaT细胞恶性转化的分子机制,为扇贝多肽防治UVB辐射致皮肤癌提供理论依据。方法采用CCK8法筛选并确定UVB辐射诱导的HaCaT细胞恶性转化的单次辐射剂量,Gimsa染色观察细胞形态初步确立UVB辐射诱导HaCaT细胞恶性转化的终点,软琼脂克隆形成实验、明胶酶谱法检测MMP-9蛋白酶的分泌证明UVB辐射诱导HaCaT细胞恶性转化模型的成功。实验设计分为4组：正常对照组、UVB模型组、UVB+2.84mmol/LPCF, UVB+2.84mmol/L维生素C阳性对照组。经平板集落形成实验,软琼脂集落形成实验,流式细胞术检测细胞周期确立PCF对UVB诱导的HaCaT细胞恶性转化的抑制作用；RT-PCR检测甲基转移酶DNMTs(DNMT1、DNMT3a, DNMT3b)mRNA经时(UVB辐射4、8、16、20次)表达；蛋白印迹法检测GADD45a, DNMT3b, P16及RASSFIA蛋白经时(UVB辐射4、8、12、16、20次)表达。以高分辨率溶解曲线(MS-HRM)检测PCF对处于UVB诱导的HaCaT细胞恶性转化各阶段(4次、12次、20次)中P16、RASSF1A基因甲基化的程度。结果UVB(波长峰值297nm)照射的辐照强度约在1luw/cm2,单次辐射剂量10mJ/cm2,辐射次数20次,总辐射剂量200mJ/cm2时,成功建立UVB辐射诱导的HaCaT细胞恶性转化模型；2,84mmol/LPCF比VC更明显抑制UVB辐射诱导的HaCaT细胞恶性转化(P0.05)。DNMT1和DNMT3amRNA的经时表达显示UVB辐射HaCaT细胞DNMT1和DNMT3a的表达量与辐射前相比差异无统计学意义(I0.05); DNMT3b的mRNA和蛋白的表达呈现逐渐升高的趋势,UVB辐射20次后其表达量达到高峰(P0.05); Gadd45a蛋白经时变化显示UVB辐射4次时即可检测表达量达到高峰,随后表达量逐渐下降,UVB辐射20次后蛋白表达到低谷(P0.05)；P16和RASSF1A蛋白经时变化显示UVB辐射后表达量逐渐下降,UVB辐射20次后蛋白表达到低谷(P0.05)；PCF和VC均可抑制P16和RASSFIA基因的甲基化(P0.05),促进P16, RASSFIA和GADD45a蛋白的表达(P0.05),抑制DNMT3b蛋白的表达(P0.05)且与VC相比,PCF效果更显著(P0.05)。结论国际上首次建立模拟日光紫外线B辐射诱导的HaCaT细胞恶性转化模型,揭示P16和RASSFIA基因的高甲基化与HaCaT细胞恶性转化密切相关。证明扇贝多肽通过调节DNMT3b和GADD45a基因表达而抑制P16和RASSF1A基因的高甲基化,阻上UVB辐射诱导的HaCaT细胞恶性转化。
[Abstract]:Objective to establish a pathological model of malignant transformation of HaCaT cells induced by simulated solar ultraviolet B radiation, and to study the molecular mechanism of the inhibition of UVB induced malignant transformation of HaCaT cells by chlamyfish polypeptide (PCF) from the point of view of Gadd45a,DNMTs,P16 and RASSF1A gene methylation. It provides a theoretical basis for the prevention and treatment of skin cancer induced by UVB radiation. Methods CCK8 method was used to screen and determine the single dose of malignant transformation of HaCaT cells induced by UVB radiation. The terminal point of malignant transformation of HaCaT cells induced by UVB radiation was preliminarily established by Gimsa staining. Detection of the secretion of MMP-9 protease by gelatinase assay proved that the model of malignant transformation of HaCaT cells induced by UVB radiation was successful. The experimental design was divided into 4 groups: normal control group, UVB model group, UVB 2.84 mmol / L PCF, UVB 2.84mmol/L vitamin C positive control group. The inhibitory effect of PCF on the malignant transformation of HaCaT cells induced by UVB was determined by flow cytometry, and the expression of DNMTs (DNMT1,DNMT3a, DNMT3b) mRNA (20 times UVB radiation) was detected by RT-PCR. The expression of GADD45a, DNMT3b, P16 and RASSFIA protein was detected by Western blot. High resolution dissolution curve (MS-HRM) was used to detect the methylation of P16 RASSF1A gene in the malignant transformation of HaCaT cells induced by UVB (4 times, 12 times, 20 times) by PCF. Results the malignant transformation model of HaCaT cells induced by UVB radiation was successfully established when the irradiation intensity of UVB (wavelength peak 297nm) was about 1luw / cm ~ (2), the single dose was 10 mg / cm ~ (2), the number of times was 20 times, and the total radiation dose was 200mJ/cm2. (2) 84 mmol / L LPCF inhibited the malignant transformation of HaCaT cells induced by UVB radiation more significantly than VC (P0.05). The expression of DNMT1 and DNMT3a in HaCaT cells irradiated with DNMT1 and DNMT3amRNA was not significantly different from that in HaCaT cells irradiated with UVB (I0.05), and the mRNA and protein expressions of DNMT3b were observed. After 20 times of UVB radiation, the expression of Gadd45a protein reached the peak (P0.05), and the expression of Gadd45a protein reached the peak after 4 times of UVB radiation. The expression of P16 and RASSF1A decreased gradually after 20 times of UVB irradiation (P0.05), and the expression of P16 and RASSF1A decreased gradually after 20 times of UVB irradiation (P0.05). Both PCF and VC could inhibit the methylation of P16 and RASSFIA genes (P0.05), promote the expression of P16, RASSFIA and GADD45a (P0.05), inhibit the expression of DNMT3b (P0.05), and PCF was more effective than VC (P0.05). Conclusion the model of malignant transformation of HaCaT cells induced by simulated ultraviolet B radiation is established for the first time in the world. It is revealed that the hypermethylation of P16 and RASSFIA genes is closely related to the malignant transformation of HaCaT cells. It was demonstrated that the polypeptide of chlamys farreri inhibited the hypermethylation of P16 and RASSF1A genes by regulating the expression of DNMT3b and GADD45a genes and prevented the malignant transformation of HaCaT cells induced by UVB radiation.
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R739.5

【共引文献】

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本文编号：2281779