花椒挥发油改善心得安所致豚鼠耳部银屑病样局部皮肤病变的药理作用研究

发布时间：2018-10-20 14:44

【摘要】：背景银屑病(psoriasis)俗称“牛皮癣”,是一种常见的皮肤病。因为它的皮疹表现为红色斑疹、丘疹或斑块,上面覆有多层银白色的鳞屑,这种特征性的表现是银屑病病名的来源,其病理表现为,角质形成细胞增殖过度伴角化不全,真皮毛细血管扩张,以及炎症细胞浸润。银屑病的病因并不完全清楚且顽固难治,被世界卫生组织列为十大顽症之一。银屑病的发病机制近年来已有了许多新的研究和成果,但是。银屑病临床表现复杂多变,病因尚不完全清楚。就目前的研究情况而言,银屑病与遗传、感染、代谢障碍、免疫功能紊乱、内分泌失调有关。近年来,多数学者认为银屑病的发病是一种多基因遗传多因素作用参与的T细胞免疫介导性皮肤病,其发病机制复杂。其中CD4+T淋巴细胞免疫功能异常在其发病中尤为重要。CD4+T淋巴细胞主要分为Th1和Th2两大亚群。Th1分泌IFN-γ和IL-12等细胞因子,以分泌IFN-γ为特征；而Th2分泌IL-4、IL-2等细胞因子,以分泌IL-4为特征,IFN-γ和IL-4分别是Th1和Th2细胞亚群标志性细胞因子。研究发现,银屑病的发病与Th1/Th2细胞因子失衡有关,银屑病皮损组织中大量聚集CD4+T细胞,活化的角质形成细胞分泌的细胞因了作用于T细胞,进一步促进其成熟。T细胞和角质形成细胞分泌的细胞因了形成细胞因子网络,致使出现银屑病的病理损伤。就目前抗银屑病的药物发展来看,传统的外用药物起到的治疗作用不大,系统疗法中的各种口服药物虽有一定的治疗作用,但同时具有较强的副作用。而生物治疗虽是抗银屑病药物的发展方向,但现在用于临床的药物较少还不够成熟且治疗成本较高。我国传统医药对银屑病的治疗也有相当长的历史,临床上中药治疗银屑病除遵循传统中医药学辨证施治原则外,可辨证选用中药或提取中药的主要有效成分对银屑病进行治疗。花椒是芸香科植物花椒Zanthoxylum ungeanum的干燥成熟果实,花椒药用历史悠久,《本草纲目》记载其味辛,性温,有小毒,麻,归脾、胃、肾经,主治风邪气,出寒痹,入肺散寒,入脾除湿,水肿泻痢。其化学成分主要有生物碱、酰胺、木脂素、香豆素、挥发油和脂肪酸等。对心血管系统、消化系统、免疫机能、凝血功能、镇痛、镇静、抗炎、抑菌杀虫、抗肿瘤等均具有较强的药理活性。民间一直流传利用花椒治疗银屑病的偏方,其中比较常见的是将花椒置于食用醋中,熬煮30分钟,过滤后用溶液外涂银屑病皮损处：另一种是将花椒置于高度白酒中,浸泡3-5天,过滤后用溶液外涂银屑病皮损处。两种方法均可以一定程度改善皮损红肿的状态,减小皮损面积。食用醋和高度白酒作为溶剂本身不具备治疗银屑病的作用,因此提示我们花椒的主要化学成分有可能起到改善银屑病的局部皮肤病变。随着对花椒主要化学成分尤其是对花椒挥发油药理作用的深入研究,发现其具有抗肿瘤的作用。臧林泉等人研究发现高浓度(4～16mg/ml)的花椒挥发油对人肺癌A549细胞株有杀伤作用,低浓度(1mg/ml)的花椒挥发油对A549有诱导细胞凋亡的作用。袁太宁等人研究发现,花椒挥发油可在体外有效抑制小鼠H22肝癌细胞、人肺癌A549细胞周期的正常转换,阻止细胞的有丝分裂、抑制细胞生长并激发程序性细胞凋亡。李品艾等人发现花椒挥发油具有直接抑制胃癌SGC-7901细胞增殖、促进其凋亡的作用。国外研究报道,花椒挥发油中富含的异戊二烯萜类物质可通过对肿瘤细胞周期的阻滞和诱导细胞凋亡发挥抗肿瘤作用。异戊二烯萜类中的右旋柠檬烯抗肿瘤活性较强,对多种肿瘤具有治疗作用。花椒挥发油确实可以抑制多种肿瘤细胞的增殖,并且可以通过对肿瘤细胞周期的阻滞,阻止其正常有丝分裂从而达到抑制细胞生长诱导其凋亡的作用。为花椒挥发油改善心得安所致豚鼠耳部银屑病样局部皮肤病变,提供了可能的理论依据。为此我们构建了豚鼠银屑病样病理模型,观察花椒挥发油外用的疗效,以期为花椒挥发油治疗银屑病的研究提供最初的依据。国内迄今未见花椒挥发油治疗银屑病的相关实验或临床报道。目的本实验用微波辅助萃取法从陕西产“大红袍”花椒中提取花椒挥发油,并用气相色谱-质谱联用分析花椒挥发油的主要成分。制备花椒挥发油DMSO溶液。建立豚鼠耳部部位银屑病样动物模型,通过5%花椒挥发油DMSO溶液、20%花椒挥发油DMSO溶液、及阳性对照药物(哈西奈德乳膏)平行外用给药,观察花椒挥发油对银屑病样动物模型组织学评分、炎症细胞浸润情况及心、肝、肺、肾等重要脏器的病理学影响,旨在探讨花椒挥发油外用对改善银屑病样动物模型病理的可行性。同时采集豚鼠耳部银屑病样皮损组织,均浆后用酶联免疫法(ELISA)测定皮损组织中的IFN-γ和IL-4的浓度,研究造模前后及花椒挥发油治疗后,对豚鼠皮损组织中IFN-γ和IL-4表达的影响。旨在探讨花椒挥发油溶液外用对改善银屑病样动物模型病理可能的机制。方法微波辅助提取花椒挥发油,实验条件为：物料比,花椒(g)：乙醇(ml),1：12；微波功率390kw；微波辅助提取时间6min；提取初始温度60℃。 GC-MS实验条件：色谱条件：AB-5MS毛细管色谱柱(30m×0.25mm×0.25μm)；程序升温：柱温起始60℃,保持1min,以3℃/min升至120℃,再以8℃/min升至220℃,保持1min。载气为He气,流速1.0ml/min；进样口温度230℃；分流进样,分流比1：100,进样量为0.02μl；接口温度为230℃。质谱条件：EI源电子能量70eV,离子源温度230℃；质量扫描范围：45～350amu：溶剂延迟3min。银屑病样动物模型的制备：5%心得安软膏均匀涂抹豚鼠耳部外侧,每日3次,连续3周,使豚鼠耳部皮肤出现角化过度、炎症细胞浸润增加等典型银屑病病理改变,建立银屑病样模型。实验动物分组处理：健康成年豚鼠随机分为7组。组1：空白对照组,正常饲养x5W；组2：造模组,造模成功后切取耳部标本及脏器标本；组3：造模后观察组,造模成功后不作任何处理,饲养x2W；组4：溶剂对照组,造模成功后耳部外侧涂40%DMSO溶液,tidx2W；组5：阳性对照组,造模成功后耳部外侧涂哈西奈德乳膏,tid×2W；组6：花椒挥发油高剂量组,造模成功后耳部外侧涂20%花椒挥发油DMSO容液,tid×2W；组7：花椒挥发油低剂量组,造模成功后耳部外侧涂5%花椒挥发油DMSO溶液,tidx2W。组织标本的制备：各组豚鼠到预定时间后,以颈椎脱位法处死,取耳部标本及内脏标本,10%甲醛溶液固定,石蜡包埋,切片,HE染色,光镜观察皮肤病理变化。豚鼠耳部皮肤组织匀浆样品的制备：切取各组豚鼠双侧耳部标本,用预冷生理盐水冲洗,拭干,分别切取耳部皮肤1.0g,精确称量,放入含1.0ml生理盐水的试管中,用高速分散机10000rpm匀浆两次,10s/次,用3000rpm离心10min,取上清液待测。实验疗效评估：每只豚鼠两侧耳部各制作3张切片,光学显微镜10×20视野下随机选取5个视野,利用计算机图像分析软件,对选取视野进行图像分析,参照Baker法进行组织学积分评估,并对炎症细胞进行计数。比较各组数据的统计学差异。用SPSS18.0统计软件,全部数据以均值±标准差(x±s)表示,进行方差齐性检验,组间均数比较若方差齐则采用单因素方差分析(One-Way ANOVA),若方差不齐采用校正的Welch方法。若Levene检验方差齐,用Bonferroni法；若Levene检验方差不齐,用Dunnett'sT3法,P0.05差异有统计学意义。 ELISA法检测皮损组织中IFN-y和IL-4的浓度：将特异性抗体与固相载体连接,形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间,让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合,形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。颜色的深浅和样品中的IFN-γ和IL-4呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。结果 1.花椒挥发油提取及成分分析提取所得花椒挥发油为红褐色,得率12.92%。GC-MS分析主要成分20种。 2.豚鼠耳部皮肤HE染色情况各组豚鼠耳部组织Baker评分(x±s),进行方差齐性检验,Levene检验方差齐(P=0.076)。单因素方差分析(One-Way ANOVA)表明各组Baker评分(x±s)差异有统计学意义(F=236.816,P0.001)。各组豚鼠耳部组织炎症细胞浸润计数(x±s),进行方差齐性检验,Levene检验方差不齐(P0.001),校正的Welch方法的分析结果表明各组炎症细胞浸润计数(x±s)差异有统计学意义(F=278.977,P0.001)。组1(正常对照组)镜下见皮肤结构完整,表皮层未见角化过度、角化不全、颗粒层缺乏、棘层肥厚；真皮层未见结缔组织血管扩张充血或水肿,真皮内散在炎性细胞浸润,Baker评分0.75±0.44,炎症细胞浸润数22.15±2.82。组2(造模组)镜下可见表皮层广泛角化过度,棘层增厚,皮突延长并成波浪状起伏,其中3例可见Munro小脓肿；真皮层内血管扩张充血、水肿、轻度至中度炎性细胞浸润,Baker评分6.48±0.83,炎症细胞浸润数90.45±9.18。两两比较结果表明空白对照组和造模组的Baker评分及炎症细胞浸润数相比,差异有统计学意义(P值均小于0.001),提示造模成功。组3(造模后观察组)、组4(溶剂对照组)镜下所见与组2相似,Baker评分分别为6.35±0.75和6.10±0.68；炎症细胞浸润数分别为88.65±7.60和85.85±8.05。两两比较结果表明组2与组3的Baker评分及炎症细胞浸润数相比,差异无统计学意义(P值均等于1.000)；组2与组4的Baker评分及炎症细胞浸润数相比,差异无统计学意义(P=1.000；P=0.850),提示该病理改变在不接受5%心得安软膏刺激的情况下可以维持2w不改变,花椒挥发油溶液基质(40%DMSO溶液)无治疗作用。组5(阳性对照组)、组6(花椒挥发油高剂量组)、组7(花椒挥发油低剂量组)镜下可见皮肤结构完整,表皮层角化过度程度减轻,棘层增厚程度减轻,皮突延长程度减轻,未见Munro小脓肿；真皮层内血管扩张充血、水肿程度减轻,炎性细胞浸润减少。Baker评分分别为2.45±0.71、3.13±0.56、4.60±0.45；炎症细胞浸润数分别为36.35±3.87、40.25±4.06、61.65±5.07。两两比较结果表明组5的Baker评分及炎症细胞浸润数与组3相比,差异有统计学意义(P值均小于0.001)；组6的Baker评分及炎症细胞浸润数与组3相比,差异有统计学意义(P值均小于0.001)；组7的Baker评分及炎症细胞浸润数与组3相比,差异有统计学意义(P值均小于0.001),提示花椒挥发油溶液对豚鼠耳部的银屑病样病理改变和炎症现象具有抑制作用。另外,两两比较结果表明组6与组7的Baker评分及炎症细胞浸润数相比,差异有统计学意义(P值均小于0.001),提示20%的花椒挥发油溶液较5%的花椒挥发油溶液更能改善心得安所致的豚鼠耳部银屑病样局部皮肤的病理改变。 3.豚鼠脏器组织HE染色结果各组豚鼠心、肝、肺、肾等重要脏器均未见病理性结构改变。 4.ELISA法测定各组豚鼠皮肤组织匀浆中IFN-γ和IL-4浓度。各组豚鼠耳部组织匀浆中IFN-γ测定结果(x±s),进行方差齐性检验,Levene检验方差齐(P=0.421),作单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差分析表明各组豚鼠耳部组织匀浆中IFN-y测定结果(x±s)差异有统计学意义(F=130.850,P0.001)。两两比较结果表明与组1比较,组2、组3、组4皮损中的IFN-γ浓度均升高,差异有统计学意义(P值均小于0.001)。组2与组3相比,差异无统计学意义(P值均等于1.000)。提示5%心得安软膏外用致使豚鼠耳部皮损组织中的IFN-y表达增加,并不会在造模2w后以及在空白溶剂基质给药2w后出现下降。与组3比较,组5、组6、组7皮损中的IFN-γ浓度均降低,差异有统计学意义(P值均小于0.001)。组6与组7相比,差异有统计学意义(P=0.008)。提示花椒挥发油溶液能够使豚鼠银屑病样皮损组织中IFN-γ的表达下降,并且与花椒挥发油的浓度成正相关。各组豚鼠耳部组织匀浆中IL-4测定结果(x±s),进行方差齐性检验,Levene检验方差齐(P=0.590),作单因素方差分析(One-Way ANOVA),方差分析表明各组豚鼠耳部组织匀浆中IL-4测定结果(x±s)差异无统计学意义(F=0.796,P=0.578)。两两比较结果表明与组1(空白对照组)比较,组2(造模组)、组3(造模后观察组)和组4(溶剂对照组)豚鼠耳部组织中IL-4的浓度,差异无统计学意义(P值均等于1.000)。与组3(造模后观察组)比较,组5(阳性对照组)、组6(花椒挥发油高剂量组)和组7(花椒挥发油低剂量组)豚鼠耳部组织中IL-4的浓度差异无统计学意义(P值均等于1.000)。与组5比较,组6、组7豚鼠耳部组织中IL-4的浓度差异无统计学意义(P值均等于1.000)。与组6比较,组7豚鼠耳部组织中IL-4的浓度差异无统计学意义(P=1.000)。提示造模前后未见豚鼠皮损中IL-4的表达发生变化,经哈西奈德乳膏、浓度为20%和5%花椒挥发油溶液外用给药治疗后,未见豚鼠皮损中IL-4的表达发生变化。结论 1、微波辅助提取条件：微波功率390w、微波辅助提取时间6mmin、溶剂用量1：12(g/ml)、提取初始温度60℃。花椒挥发油的提取率为12.92%。GC-MS对花椒挥发油进行分析,通过MSD化学工作站进行分析,检索NIST05谱库,分别对总离子流图中的主要峰进行逐一解谱,确定组分20种,占总峰面积的91%。其中最主要的成分为：柠檬烯、桉叶脑、蒎烯等。 2.花椒挥发油DMSO溶液外用可减轻豚鼠耳部银屑病样模型的局部病理改变,并且与花椒挥发油的浓度成正相关。 3.花椒挥发油DMSO溶液外用可使豚鼠银屑病样皮损组织中IFN-γ的表达下降,并且与花椒挥发油的浓度成正相关。 4.花椒挥发油DMSO溶液外用未见豚鼠耳部银屑病样组织中IL-4的表达发生变化。 5.花椒挥发油DMSO溶液外用未见局部刺激、过敏症状,未见实验动物心、肝、肺、肾等主要脏器发生病理学改变。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R758.63

【参考文献】