【摘要】：目的黑色素瘤是恶性程度最高的皮肤肿瘤之一,占据皮肤癌死亡率的80%。随着对肿瘤发生发展过程中,免疫系统所发挥的作用和机制的了解,免疫疗法在黑色素瘤的治疗中备受关注,目前也已经取得了一定的进展。由于黑色素瘤能够表达特异性的抗原,因此利用黑色素瘤抗原制备肿瘤疫苗用于黑色素瘤的治疗被认为是一种具有潜力的治疗黑色素瘤免疫方法。DC肿瘤疫苗是指通过体外分离DC,荷载肿瘤抗原,并进行相应处理增强其免疫刺激能力,回输至患者体内,通过激发肿瘤特异性免疫反应进行肿瘤治疗的一类肿瘤疫苗。在DC肿瘤疫苗制备中,在荷载肿瘤抗原的基础上,辅以佐剂处理DC肿瘤疫苗,能够有效地促进DC的成熟,改善疫苗的治疗效果。因而,筛选可用于DC疫苗制备的有效佐剂是DC疫苗制备中的关键问题。基于TLR激动剂具有促进DC成熟的作用,其常被用作制备DC肿瘤疫苗的佐剂。近来,一个新型的TLR激动剂HP-NAP,在刺激免疫应答及抗肿瘤中的作用受到广泛关注。在本工作中,我们利用大肠杆菌表达系统表达了HP-NAP,并进一步对其促进DC成熟,作为抗黑色素瘤DC疫苗佐剂的潜力进行了研究。以期获得一种有效地用于制备抗黑色素瘤DC疫苗的佐剂。方法1.利用实验室前期保存的p ET28a-His-NAP-E.coli BL21(DE3)菌株诱导表达HP-NAP,经亲和层析法纯化得到纯HP-NAP蛋白,去除内毒素后保存于-80℃冰箱备用。2.取C57BL/6小鼠骨髓细胞,经GM-CSF和IL-4诱导分化得到DC。3.以不同浓度的HP-NAP,对C57BL/6小鼠来源的DC进行刺激。流式细胞术对DC表面共刺激分子CD80、CD86的表达进行检测;荧光定量PCR法测定细胞因子IL-12、IL-1β在m RNA水平表达的变化。确定HP-NAP发挥作用的最适浓度。4.分别对野生型和TLR2缺陷型C57BL/6小鼠来源的DC给以相同浓度的HP-NAP刺激,流式细胞术对其表面共刺激分子CD80的表达进行检测,确定HP-NAP对DC的刺激作用是否依赖于TLR2信号通路。5.向DC培养体系中加入B16F10-TCL和HP-NAP进行刺激。流式细胞术对DC表面共刺激分子CD80、CD86,趋化因子受体CCR7的表达变化以及DC抗原吞噬能力进行检测;荧光定量PCR法对DC表达细胞因子IL-12、IL-23及IL-1β在m RNA水平的表达变化进行检测,确定HP-NAP对荷载B16F10-TCL的DC成熟的影响。6.经HP-NAP和B16F10-TCL处理DC细胞,与尼龙毛柱法纯化得到的T细胞共培养,MTT法检测T细胞的增殖情况;流式细胞术检测T细胞表面早期活化Marker CD69的表达变化;ELISA检测上清中IFN-γ及IL-17A的浓度;荧光定量PCR法检测IL-4、IL-10在m RNA水平的变化。7.对C57BL/6小鼠进行两次200μg/只的B16F10-TCL的皮下注射,两次注射之间间隔5天,第二次注射5或6天后取小鼠脾脏细胞,尼龙毛柱纯化抗原特异性T细胞,与经HP-NAP和B16F10-TCL处理的DC共培养后,荧光定量PCR法检测颗粒酶及穿孔素在m RNA水平的变化;ELISA法检测上清中IFN-γ的浓度;以其作为效应细胞,与B16F10按照10:1,20:1,40:1的比例共培养6小时,LDH法检测T细胞的杀伤能力。结果1.表达纯化的HP-NAP纯度及浓度达到实验需求。2.诱导分化的DC纯度85%以上,可以用于后续实验。3.HP-NAP对DC的成熟有促进作用,1μM为HP-NAP对DC发挥刺激作用的最适浓度,选择该浓度进行后续实验。4.HP-NAP刺激后,野生型C57BL/6小鼠来源的DC表面的CD80表达显著上调,而TLR2缺陷型C57BL/6小鼠来源的DC表面的CD80的表达无明显改变。5.HP-NAP和B16F10-TCL处理后的DC表面共刺激分子CD80、CD86及趋化因子受体CCR7表达量显著上升,抗原吞噬能力显著下降;HP-NAP和B16F10-TCL处理后的DC表达细胞因子IL-12、IL-23、IL-1β的水平显著上调。6.HP-NAP和B16F10-TCL处理后的DC刺激T细胞增殖和活化的能力显著上升。HP-NAP和B16F10-TCL处理后的DC可以显著上调T细胞表达IFN-γ。7.HP-NAP和B16F10-TCL处理后的DC能够刺激抗原特异性的T细胞合成细胞毒作用效应分子Granzyme B和Proforine,并显著上调IFN-γ的表达。HP-NAP和B16F10-TCL处理后的DC诱导抗原特异性CTL的能力显著增强。结论1.HP-NAP通过TLR2发挥对DC成熟的刺激作用。2.HP-NAP能够促进荷载B16F10-TCL的DC的成熟。3.HP-NAP处理的荷载B16F10-TCL的DC刺激T细胞增殖和活化的能力显著增强并介导Th1型免疫应答。4.HP-NAP显著增强荷载B16F10-TCL的DC激发CTL的能力。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R739.5
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本文编号：2340851
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