CpG-c41对胞内型TLRs介导的免疫抑制效应及其对银屑病治疗作用的研究

发布时间：2018-12-27 08:41

【摘要】：自身免疫性疾病(Autoimmune disease,AID)是一类由多种因素导致的慢性炎症性疾病,发病机制复杂,至今尚未完全阐明。目前临床治疗这类疾病的药物疗效不佳,副作用大,导致疾病反复发作。越来越多的研究显示,AID与固有免疫和适应性免疫紊乱密切相关。其中,在固有免疫系统激活过程中,模式识别受体(pattern recognition receptor,PRRs)扮演着重要角色,它们能特异性识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),从而活化相关信号通路导致一系列免疫炎症反应。然而正是这些受体的过度活化,导致一系列AID的发生,如类风湿性关节炎(RA),系统性红斑狼疮(SLE)和银屑病(Psoriasis)。那么,探索并围绕AID发病机制寻找药物靶标,已成为当今治疗免疫性疾病的突破口。重要的PRRs有Toll样受体(TLRs)和NOD样受体(NLRs),它们能够特异性地识别病毒、细菌、真菌和寄生虫特定的组分,构成了固有免疫的第一防线。在TLRs家族中,根据其亚细胞定位可分为两大类,即:细胞膜表面TLRs(TLR4/MD-2,TLR1,TLR2和TLR6)和位于内质网和内体上的细胞内型TLRs(TLR3,TLR7/8和TLR9)。然而,值得注意的是,第一、TLRs受体的识别具有特异性,比如:TLR3和TLR7/8识别病毒dsRNA和ssRNA,而TLR9识别微生物DNA产生的未甲基化Cp G基序;第二、不同的TLRs对应的下游信号通路不同,如:TLR3通过TRIF信号通路,TLR7通过MyD88,导致大量炎症因子(TNF-ɑ、IL-6和干扰素等)的释放。NLRs作为另一类重要的细胞内型PRRs,参与识别宿主来源和微生物的损伤相关分子(damage associated molecular patterns,DAMPs)。其中NLRP3作为NLRs蛋白家族成员之一,广泛表达于DCs和巨噬细胞。由NLRP3、ASC和无活性的caspase-1前体组成的复合体称为NLRP3炎症小体,具有调控机体慢性炎症反应的功能,是内源性或外源性危险信号的胞质内感受器。它能够活化caspase-1,调控IL-1β和IL-18等促炎因子的成熟和分泌。近年来,越来越多的研究显示AID与固有免疫中的多种PRRs的过度活化密切相关。然而,不同PRRs具有各自对应的信号通路,这种多对多的方式,使得在信号通路上寻找治疗靶位,变得尤为复杂。为了对抗这种多因子诱发的炎症反应,目前的药物开发侧重于效应阶段的遏制,譬如,在治疗银屑病时,采用TNF-?、IL-17或IL-23的抗体。尽管这种后端靶标的治疗策略,能够改善炎症因子发生后续的免疫损伤,但是对免疫的干预面太大,而伴随着免疫系统损耗,严重感染等不良反应。因此,如果在致病前端过程,寻找有效的靶标,阻断免疫系统激活,降低副作用,这将是一个更好的策略。但前端受体较多,目前仍然没有发现合适的靶标与药物。我们前期报道了一段包含未甲基化Cp G结构的20bp寡聚核苷酸(CpG-ODN)序列,命名为CpG-c41(5'-TGGCGCGCACCCACGGCCTG-3'),可高效抑制TLR9介导的炎症反应。后来研究发现,CpG-c41亦可显著抑制TLR7的活化,改善由酵母多糖(Zymosan)诱导的RA炎症,说明其具有了成药可能。然而,CpG-c41安全性如何,对其它TLRs是否也有影响,是否对于AID起到很好的治疗作用。为了探究CpG-c41在一定范围内的安全性和免疫学作用特点,在本课题我们进行了以下研究:目的对通过生物信息学技术,高通量筛选出的无免疫刺激性CpG-c41分子,进行初步安全性评价;探究其对不同TLRs介导的免疫学效应的影响及其机制;构建咪喹莫特乳膏(Imiquimod,IMQ)诱导的银屑病样小鼠模型,观察CpG-c41对该模型的治疗作用。方法1、CpG-c41初步安全性评价动物急性毒性试验,Balb/c小鼠12只,雌雄各半,分为实验组和对照组,每组6只。实验组一次性尾静脉注射治疗剂量10倍(80mg/kg)的CpG-c41,对照组尾静脉注射等体积生理盐水(norman saline,NS),初步观察CpG-c41对动物的急性危害性质和危害强度。体外细胞毒性实验,通过CCK-8实验观察高浓度下CpG-c41(2-64μM)对于L929细胞活性的影响。2、CpG-c41对不同TLRs介导的免疫学效应研究(1)CpG-c41对不同TLRs介导的炎症因子释放的影响体外实验,使用TLR2,3,4,7/8,9激动剂分别刺激BMDMs,BMDCs和Thp-1细胞,另外联合使用TLR3,7/8,9激动剂中的两种刺激RAW264.7,同时给予Cp G-c41(4μM)进行干预。24h后ELISA检测各组细胞上清中TNF-ɑ、IL-6表达水平。各激动剂终浓度:TLR2激动剂(Zymosan,200μg/ml),TLR3激动剂(Poly(I:C),100μg/ml),TLR4激动剂(LPS,100ng/ml),TLR7激动剂(Imiquimod,2μg/ml),TLR7/8激动剂(ss RNA120,30μg/ml)与DOTAP混合后使用,TLR7激动剂(R848,0.2μg/ml)和TLR9激动剂(Cp G-1826,2μM)。体内实验,野生型(WT)小鼠(18-20g)腹腔分别注射TLR3,7,9激动剂,治疗组尾静脉注射CpG-c41(320μg/20g),安慰剂组尾静脉注射等体积生理盐水。ELISA检测各组各时相点血清中TNF-ɑ、IL-6、IFN-ɑ和IL-12/23p40的水平。各激动剂终浓度:TLR3激动剂(polyI:C,40μg/20g),TLR7激动剂(R848,10μg/20g)和TLR9激动剂(Cp G-1826,160μg/20g)。(2)CpG-c41对胞内型TLRs介导的炎症小体形成和活化的干扰使用TLR3,4,7,9激动剂分别刺激WT BMDMs和RAW264.7细胞,同时给予Cp G-c41(8μM)进行干预,4h后加入ATP诱导30min。Western blot检测各组在BMDMs细胞中NLRP3和Caspase-1蛋白变化;ELISA检测RAW264.7细胞上清中IL-1β的水平。各激动剂终浓度:TLR3激动剂(Poly(I:C),100μg/ml),TLR4激动剂(LPS,100ng/ml),TLR7激动剂(R848,1μg/ml)和TLR9激动剂(CpG-1826,3μM)(3)CpG-c41多重免疫抑制效应与TLR9的关系分离培养TLR9-/-BMDMs,使用TLR3,7,9激动剂刺激,同时给予Cp G-c41(4μM)进行干预。24h后ELISA检测各组细胞上清中TNF-ɑ、IL-6表达水平。各激动剂终浓度:TLR3激动剂(polyI:C,100μg/ml),TLR7激动剂(Imiquimod,2μg/ml),TLR7/8激动剂(R848,0.2μg/ml)和TLR9激动剂(CpG-1826,2μM)。3、CpG-c41对于银屑病的治疗作用研究使用IMQ(45 mg/鼠)诱导银屑病样小鼠模型,治疗组皮下注射CpG-c41(320μg/鼠),安慰剂组皮下注射等体积生理盐水。连续6天,每天观察各组皮肤损伤情况,进行PASI评分。与此同时取第24h、72h和7天的损伤皮肤,对主要免疫细胞(巨噬细胞,T细胞)以及关键性细胞因子(IL-23p19)进行原位免疫荧光染色,观察浸润情况。同时第7天取损伤皮肤做病理切片。结果1、CpG-c41初步安全性评价动物急性毒性实验发现,实验组和对照组均未出现明显不良症状;L929细胞毒性试验显示,各梯度浓度Cp G-c41组L929细胞活性与对照组无差异(p0.05)。表明,在实验浓度范围内,作为核酸序列的CpG-c41安全性良好。2、CpG-c41选择性抑制胞内型TLRs介导的免疫反应(1)CpG-c41降低胞内型TLRs介导的炎症因子释放DCs和巨噬细胞是主要的固有免疫细胞,表达多种TLRs。所以我们以BMDMs和BMDCs细胞为对象,采用不同的TLRs激动剂进行刺激,同时加入Cp G-c41进行干预。ELISA检测发现,各TLRs激动剂均能诱导大量TNF-α和IL-6的产生。而Cp G-c41选择性的抑制TLR3、7和9激动剂诱导的炎症因子释放(P0.01),但是对于TLR2/4无此作用(P0.05)。由于小鼠免疫细胞不表达TLR8,所以我们使用人THP-1为研究细胞。使用本课题组前期开发的TLR7/8激动剂ssRNA120进行刺激,同时加入CpG-c41进行干预。ELISA检测发现,ss RNA120能诱导该细胞产生大量前炎症因子。而Cp G-c41能够显著抑制这些因子的释放(P0.01)。TLR3,7/8和9属于胞内型受体,而TLR2/4属于细胞膜表面受体,根据上述实验结果显示,Cp G-c41能够显著抑制TLR3、7、8和9的活化,说明Cp G-c41能够有效抑制胞内型TLRs介导的免疫反应。随之我们观察了Cp G-c41对于两种胞内型TLRs共活化的影响。ELISA检测结果显示,CpG-c41能够显著降低两种胞内型TLRs激动剂诱发的细胞因子产生(P0.01)。表明Cp G-c41亦可同时抑制两种胞内型TLRs的活化。在动物水平,我们研究了Cp G-c41对于小鼠体内胞内型TLRs活化的影响。向小鼠体内腹腔注射胞内型TLRs激动剂刺激,同时尾静脉注射CpG-c41进行干预。ELISA检测各时相点血清显示,各TLRs激动剂能够在1-3h内诱导小鼠体内免疫细胞产生大量细胞因子。而Cp G-c41能够显著抑制多种细胞因子的释放(P0.01)。(2)CpG-c41抑制胞内型TLRs介导的炎症小体形成和活化Western blot和ELISA检测发现LPS、R848和CpG-1826能够有效诱导NLRP3表达,caspase-1的产生和IL-1β的释放,而CpG-c41选择性降低由TLR7和9介导的这一效应(P0.01),对于TLR4介导的无影响(P0.05)。有报道称,TLR3激动剂也可有效诱导NLRP3炎症小体的形成和活化,但在本次实验中未能检测该效应。(3)CpG-c41多重免疫抑制效应非依赖于TLR9我们以TLR9-/-BMDMs细胞为研究对象,观察TLR9在Cp G-c41发挥免疫抑制效应中扮演的角色。ELISA检测发现,TLR9激动剂CpG-1826未能诱导TLR9-/-BMDMs产生大TNF-ɑ和IL-6,说明TLR9敲除成功。TLR3和7激动剂能够刺激TLR9-/-BMDMs产生大量TNF-ɑ和IL-6,而CpG-c41干预后,炎症因子水平明显降低(P0.01)。结果提示Cp G-c41抑制胞内型TLRs的活化非依赖于TLR9.3、CpG-c41有效改善IMQ诱导的银屑病样小鼠皮肤损伤与安慰剂组相比,Cp G-c41治疗组皮损症状明显减轻,皮肤较光滑,鳞屑稀少,红斑色浅,浸润增厚较轻,PASI评分显著降低(P0.01)。而病理切片显示乳头瘤样增生,棘层肥厚,角化不全得到改善。并且CpG-c41治疗组巨噬细胞和T细胞浸润数量和IL-23p19释放量明显低于安慰剂组(P0.01)。结论1、CpG-c41在高剂量下对于动物和细胞均未发现急性毒副作用,同时由于Cp G-ODN与核酸代谢类似,初步提示在实验范围浓度内,CpG-c41安全性良好。2、体内外实验一致显示,Cp G-c41有效抑制胞内型TLRs介导的炎症反应,并且能够有效抑制由胞内型TLRs介导的炎症小体形成和活化。而这种多重免疫抑制效应在TLR9-/-条件下仍然存在,表明Cp G-c41的免疫抑制效应机制非依赖于TLR9。3、CpG-c41能够显著阻断银屑病样小鼠模型皮损处免疫细胞浸润和炎症因子的产生,病情得到改善,鳞屑减少。提示Cp G-c41可有效缓解IMQ诱导的银屑病样小鼠模型皮损症状。
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【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R758.63

【参考文献】