PRL3在恶性黑素瘤转移中的作用

发布时间：2019-01-10 21:17

【摘要】：恶性黑素瘤(malignant melanoma，MM)是皮肤肿瘤中恶性程度最高的。近年来，MM在西方国家的发病率逐年升高，我国MM的发病率虽然相对较低，但人口基数大，其绝对发病人数超过全世界发病率最高的澳大利亚。MM除进展快、恶性程度高外，还具有转移早而广泛的特点，常规放疗和化疗效果均不佳。因此，深入探讨相关分子在MM转移中的作用，进一步揭示MM的转移机制，对MM的临床治疗将具有重要意义。肝再生磷酸酶(phosphatase of regenerating liver，PRLs)是新近鉴定的PTP酶家族成员，包括PRL-1、PRL-2和PRL-3三个成员。其中最早被发现的是PRL-1，之后通过分析鼠EST数据库，发现和鉴定了与PRL-1具有同源性的鼠PRL-3；2001年，Matter等从人的肥厚性心肌所构建的cDNA文库中克隆获得了人的PRL-3基因。 PRL-3与肿瘤的相关性最早出现于结肠癌的研究中，2001年，Saha等比较分析了正常直肠上皮细胞、直肠原发癌细胞与转移到肝脏的直肠癌细胞之间PRL-3表达的差异。结果表明，PRL-3基因在正常细胞与原发癌细胞中的表达均处于较低水平，在恶性程度较高的癌细胞中有中等水平的表达，而在转移到肝脏的肿瘤细胞中表达水平非常高，并且这一结果在检测的所有病例中呈现出高度的一致性，提示PRL-3与直肠癌的转移密切相关。Saha等的研究首次揭示了PRL-3与肿瘤转移之间的关系，此后关于PRL-3在肿瘤细胞系和肿瘤组织中的表达及其在肿瘤发生、发展、浸润、转移中的作用的研究不断增多，例如先后发现PRL-3在胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌组织中高表达，这种高表达与肿瘤的分化程度及转移情况密切相关，通过siRNA干扰技术抑制PRL-3的表达，可明显降低多种肿瘤细胞的增殖和侵袭能力，而转染PRL-3使其高表达可使肿瘤细胞的增殖和侵袭能力增强。这些结果均表明PRL-3在肿瘤的发生、发展，尤其是侵袭和转移中发挥重要的作用。最近的研究表明，在中、高转移性的MM细胞株B16-BL6中，PRL-3的表达水平明显高于低转移MM细胞株B16。将PRL-3转染到B16细胞后，其迁徙和浸润能力及伸展速度明显提高，尾静脉注射给裸鼠后，转染了PRL-3的B16细胞组能形成更大和更多的肝、肺MM转移灶。这一研究激起了我们深入探索PRL-3在MM侵袭和转移中的作用的兴趣。主要实验方法： 1）取皮内痣、原位黑素瘤、浸润性黑素瘤、伴淋巴结转移的黑素瘤和黑素瘤淋巴结转移灶标本，免疫组化分析PRL-3蛋白的表达水平； 2） RT-PCR分析5个MM细胞系WM793B、1205Lu、451Lu、WM-266-4和C32TG中PRL-3mRNA的表达水平，Western blot分析PRL-3蛋白表达水平； 3）选择PRL-3低表达的恶性黑素瘤WM793B细胞和PRL-3高表达的恶性黑素瘤451Lu细胞，Transwell实验分析两种细胞的体外侵袭能力，裸鼠皮下和尾静脉分别注射两种细胞，分析裸鼠体内MM的形成和转移； 4）选择PRL-3高表达的恶性黑素瘤451Lu细胞，siRNA转染，RT-PCR分析siRNA转染后PRL-3mRNA的表达水平，Western blot分析siRNA转染后PRL-3蛋白表达水平； 5）siRNA转染抑制恶性黑素瘤451Lu细胞PRL-3的表达后，光镜下观察451Lu细胞形态的变化，MTT法分析siRNA转染对451Lu细胞增殖的影响，流式细胞仪分析siRNA转染451Lu细胞的凋亡率，分别用细胞划痕实验和Transwell实验分析siRNA转染对恶性黑素瘤451Lu细胞迁移能力和体外侵袭能力的影响； 6）依据PRL-3的siRNA序列构建干涉PRL-3的慢病毒shRNA载体。空白对照组裸鼠皮下接种未经任何处理的黑素瘤细胞，空载体组裸鼠皮下接种仅以病毒空载体感染的黑素瘤细胞，实验组裸鼠皮下接种慢病毒shRNA感染的黑素瘤细胞，观察肿瘤生长情况，每3天测量肿瘤长和宽，计算肿瘤体积； 7）裸鼠尾静脉注射黑素瘤451Lu细胞(对照组)和PRL-3慢病毒shRNA感染的451Lu细胞，，3周后小鼠脱颈处死，切取肝脏、肺脏，肉眼观察各组小鼠肝脏、肺表面转移肿瘤数量，观察肿瘤成瘤情况及肝、肺转移情况。主要研究结果和结论：免疫组化结果显示在不伴有淋巴结转移的浸润性黑素瘤中，PRL-3的阳性率明显高于皮内痣(P 0.01)，而伴有淋巴结转移的黑素瘤组织和淋巴结转移灶中PRL-3的阳性率明显高于原位黑素瘤，差异有统计学意义(P 0.01)；同时，在伴有淋巴结转移的黑素瘤组织(P 0.05)和淋巴结转移灶(P 0.01)中，PRL-3的表达阳性率也明显高于不伴有淋巴结转移的浸润性黑素瘤。这些结果表明，MM发生过程中PRL-3蛋白的表达增加，尤其是发生转移时，PRL-3的表达水平会大幅度增加，说明PRL-3可能参与了MM转移的过程。分别用RT-PCR和Western blot分析WM793B、1205Lu、451Lu、WM-266-4和C32TG5个黑素瘤细胞系PRL-3mRNA和蛋白的表达水平，发现WM793B和C32TG细胞系中PRL-3表达水平较低，WM-266-4细胞系表达略高，而1205Lu和451Lu细胞系尤其是451Lu细胞系PRL-3表达水平最高。Transwell实验表明PRL-3高表达的451Lu细胞体外侵袭能力明显高于PRL-3低表达的WM793B细胞，且451Lu细胞的体内成瘤能力和转移能力也明显高于WM793B细胞。选择PRL-3表达最高的451Lu细胞，进行siRNA转染抑制PRL-3的表达，RT-PCR和Western blot验证了siRNA转染成功抑制了PRL-3mRNA和蛋白的表达，光镜下观察发现siRNA转染细胞变得更加粗短，类似上皮细胞。与空白对照组和脂质体组相比，其生长曲线右偏，细胞增殖速度减慢，凋亡率升高(P 0.01)。细胞划痕实验发现siRNA转染组在相同时间内发生定向迁移的细胞数比空白对照组和脂质体组要少得多。Transwell试验结果显示，siRNA转染组穿膜细胞数明显少于空白对照组和脂质体组（P均0.05）。我们依据PRL-3的siRNA序列构建了干涉PRL-3的慢病毒shRNA载体，裸鼠皮下分别接种未经任何处理的黑素瘤细胞作为对照、病毒空载体感染的黑素瘤细胞和慢病毒shRNA感染的黑素瘤细胞，在第18天（P 0.05）、第21天和第24天（P均0.01），慢病毒shRNA感染组细胞皮下接种形成的肿瘤明显小于对照组和空载体组。裸鼠尾静脉分别注射黑素瘤451Lu细胞(对照组)和PRL-3慢病毒shRNA感染的451Lu细胞，3周后发现慢病毒shRNA干扰PRL-3后小鼠形成转移瘤的数量明显少于对照组。本课题分析了MM组织和MM细胞系PRL-3的表达情况，发现PRL-3的表达水平与MM转移相关，进一步选择PRL-3高表达的恶性黑素瘤451Lu细胞，干扰PRL-3的表达后其细胞形态发生变化，增殖能力减弱、凋亡增加，且体外迁移能力、侵袭能力减弱，体内成瘤能力和转移能力也明显减弱，表明PRL-3在MM的增殖和转移中发挥着重要的作用，抑制PRL-3的表达和功能可以抑制MM的增殖和转移，对PRL-3的抑制有望成为治疗MM的新靶点。
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【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R739.5

【参考文献】