HPV6b型E7蛋白抗体制备及尖锐湿疣原代细胞培养研究

发布时间：2019-10-03 21:22

【摘要】：背景：人乳头瘤病毒6b型(Human papillomavirus type6b, HPV6b)属低危型HPV,其感染引起的皮肤和肛门外生殖器粘膜良性疣状增生性病变是临床常见病和多发病。宿主局部免疫抑制和/或对HPV蛋白的异常识别导致的病毒免疫逃逸和持续感染是HPV感染相关疾病难治的主要原因。因此HPV免疫致病机制及干预策略的研究将为探究HPV感染有效的治疗和预防手段打下基础。HPV早期基因编码的E7蛋白是主要的致病蛋白,在HPV持续感染乃至致癌机制中具有重要作用,也是目前HPV治疗性疫苗主要的靶位点之一。大量获得HPV6b型E7蛋白及其多克隆抗体将为进一步开展HPV6b E7蛋白的功能研究、以其为靶向的免疫学干预手段提供实验基础。同时,建立尖锐湿疣来源体外培养的稳定表达HPV基因的人角质形成细胞株对HPV免疫学致病机制的研究有重要意义。目的：本研究将在已有实验基础上进一步诱导表达大量可溶性融合蛋白GST-HPV6bE7,纯化所得的HPV6b E7蛋白免疫新西兰兔获得抗HPV6b E7血清并纯化为多克隆抗体IgG。建立正常包皮及尖锐湿疣组织来源的稳定表达HPV基因的人角质形成细胞株并鉴定HPV型别。方法：用已构建的pGEX-4T-2/HPV6b E7原核表达载体转化大肠埃希菌DH5α,应用IPTG诱导培养后收集菌液,行超声粉碎裂解菌液。二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析鉴定细菌裂解上清中的可溶性蛋白。表达的大量可溶性融合蛋白GST-HPV6b E7,经Glutathione-Sepharose4B亲和柱和凝血酶纯化获取HPV6b型E7蛋白。将纯化的HPV6b E7蛋白免疫新西兰兔并获得抗HPV6b E7血清,进一步纯化为HPV6b E7多克隆抗体IgG。采用免疫印迹及免疫荧光法分析该抗体的效价及特异性。分离正常包皮及尖锐湿疣组织的角质形成细胞采用改良法进行原代细胞培养,提取的细胞DNA经聚合酶链式反应(PCR)进行HPV型别鉴定。结果：一、GST-HPV6b E7融合蛋白的诱导、HPV6b E7蛋白纯化及鉴定将pGEX-4T-2/HPV6b E7原核表达载体转化的大肠埃希菌DH5α经0.2mMIPTG诱导、28℃培养4hr后收集的细菌裂解上清,用12%SDS-PAGE进行凝胶电泳,考马斯亮蓝染色后观察发现：在分子量37KD处出现一条明显的蛋白条带,与GST-HPV6b E7蛋白预期分子量相符。将鉴定有GST-HPV6b E7蛋白的超声粉碎上清液经亲和层析柱、凝血酶酶切及透析纯化后,用15%SDS-PAGE凝胶电泳分析显示：在分子量14KD处出现有明显的蛋白条带,与HPV6b E7蛋白预期分子质量相符。二、HPV6b E7蛋白兔多克隆抗体的制备、鉴定、纯化及效价分析将HPV6b E7蛋白免疫接种兔的血清与HPV6b E7蛋白抗原进行双向免疫扩散实验,两孔之间出现沉淀线,得血清效价达1：8。获得的血清进一步纯化,所得的抗HPV6b E7多克隆兔抗体IgG经免疫印迹鉴定发现,在分子量约14KD处出现一特异性条带,与HPV6b E7蛋白大小相符,且无杂带,说明该多克隆抗体IgG能特异的识别HPV6b E7蛋白,且IgG抗体效价超过1：5,000。三、HPV6b E7多克隆抗体IgG的免疫印迹及免疫荧光鉴定瞬时转染重组质粒pcDNA3.1(+)-GFP/HPV6b E748h后的HEK293T细胞经裂解后,蛋白提取液行HPV6b型E7蛋白兔多克隆抗体IgG的免疫印迹鉴定,结果显示在分子量约为41KD处有一特异性条带,与GFP-HPV6b E7融合蛋白大小相符。提示转染细胞有HPV6b E7表达,并被HPV6b E7多克隆抗体IgG特异性识别。成功转染重组质粒pcDNA3.1(+)-GFP/HPV6b E7的HEK293T及B16细胞行免疫荧光鉴定,结果显示HPV6b型E7蛋白兔多克隆抗体IgG可特异性识别转染细胞中表达的HPV6b E7蛋白。四、尖锐湿疣组织的角质形成细胞原代培养与鉴定分离正常包皮及尖锐湿疣组织的角质形成细胞并采用改良法进行原代细胞培养,成功培养出原代人角质形成细胞,经人乳头瘤病毒核酸扩增分型检测试剂盒型别鉴定,尖锐湿疣组织来源的角质形成细胞有HPV基因表达。结论： 1、成功表达并纯化了大量可溶性HPV6b E7蛋白。 2、免疫新西兰兔获得抗HPV6b E7蛋白多克隆抗血清,成功获得并纯化HPV6bE7多克隆抗体IgG。 3、经免疫印迹及免疫荧光法鉴定,HPV6b E7多克隆抗体IgG能特异的识别哺乳动物细胞中表达的HPV6b E7蛋白,且抗体效价超过1：5000,提示该抗体敏感性较高。 4、成功培养正常包皮及尖锐湿疣组织来源的角质形成细胞,HPV型别鉴定证实尖锐湿疣组织来源的角质形成细胞有该病毒基因表达。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R752.53

【参考文献】