沙眼衣原体E型omp1基因原核表达载体的构建及表达和纯化

发布时间：2020-03-20 21:41

【摘要】： 沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis,C.t)所致的泌尿生殖道感染近几年迅速增多,无症状和慢性C.t感染所致的前列腺炎、不孕不育、异位妊娠、慢性盆腔炎等严重危害着患者的身心健康。目前,C.t泌尿生殖道感染的迁延难治、易于复发和耗资巨大已成为共识,对C.t感染的研究已成为当今国内外研究的热点之一,C.t的预防和控制方法亟待改进。沙眼衣原体疫苗的研究便是预防措施中的重点之一。已有的研究表明沙眼衣原体主要外膜蛋白(maior outer membraneprotein,MOMP)表位决定了保护性抗体的产生,并且特异性的作为抗体的靶抗原。其相对分子质量为40×10~3,是衣原体外膜复合物的主要成分,占外膜总蛋白的60%以上,因此人们研究最多的蛋白疫苗是MOMP。 目的:构建沙眼衣原体E型主要外膜蛋白基因(omp1)的原核表达载体,并在大肠杆菌(BL-21)中融合表达及鉴定,并获得纯化和定量后的MOMP。 方法:提取C.t E型omp1染色体DNA作为模板,设计引物扩增出完整的omp1基因,与载体pGEX6p-1经双酶切后连接重组,转化至大肠杆菌BL-21;重组子经抗生素平板筛选后,挑取生长的单菌落培养至对数生长期并提取重组质粒,并用限制性核酸内切酶BamHI,NotI进行酶切分析、PCR扩增及部分序列测定等方法对重组质粒进行鉴定。然后诱导表达,IPTG诱导融合蛋白表达,细菌裂解物离心的上清和沉淀分别行SDS-PAGE电泳。以抗谷胱甘肽抗体(anti-GST—tag antibody)作为一抗行Western—blotting技术初步鉴定和PCR扩增鉴定。然后采用GST树脂亲和层析的方法纯化目的蛋白,纯化后用酶联免疫吸附(Elisa)进行蛋白定量,然后进行数据分析,评价MOMP蛋白的定量。 结果:PCR扩增产物在1200bp位置出现明显条带,并经测序鉴定与Genebank上提供的E型C.t omp1基因全序列同源性达99.92%,氨基酸序列同源性达100%,证明C.t E型omp1基因扩增成功。omp1-pGEX6p-1重组质粒经双酶切鉴定,分别在5000bp及1200bp位置出现条带,初步证明重组质粒构建成功,并且PCR扩增后在6000bp左右出现目的条带,测序结果与GenBank登陆的Ct E血清型的Bour株omp1基因序列进行对比,结果完全一致。诱导后得到66KD蛋白,并可被GST特异性抗体检测,蛋白印迹证实表达产物为特异性蛋白,用GST树脂亲和层析后也在相对分子量约66KD处有一条唯一的蛋白条带,经蛋白定量后获得高浓度的MOMP。 结论:(1)扩增到完整的C.t E型omp1基因,并成功构建了omp1-pGEX6p-1重组质粒;(2)重组质粒诱导后可表达66KD的蛋白,该蛋白可被GST特异性抗体结合;(3)重组质粒与标准omp1基因序列比对结果,并经后续的动物实验表明,目的蛋白具有免疫原性。
【图文】：

tE型完整

取s协1pCR产物经l%琼脂糖凝胶电泳，在约12，结果见图1:M220001000整。mPI基因的扩增M:DNAMarker;1:omPI扩增产物;2粒的提取取pGEX6P一1质粒后取5川直接电泳，用1%琼脂糖，可以见到质粒被成功提取出来，，电泳呈三条清晰的条
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009
【分类号】：R759

【参考文献】

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1 吴晓英,林影,陈慧英;溶菌酶的研究进展[J];工业微生物;2002年04期

2 向代军,姚学军,刘汉燕;超声处理对大肠杆菌HCV-NS_3融合蛋白纯化的影响[J];数理医药学杂志;2002年06期

本文编号：2592238