半巢式PCR-RFLP法快速鉴定皮肤癣菌病病原菌的研究

发布时间：2020-03-28 00:27

【摘要】： 皮肤癣菌病是由皮肤癣菌引起的最常见浅部真菌病。皮肤癣菌主要侵犯皮肤、毛发及指(趾)甲,寄生或腐生于表皮角质、毛发或甲板的角蛋白组织中,引起体股癣、手足癣、甲癣、头癣以及皮肤真菌性肉芽肿,而且难治愈,易复发和再感染,给人们的生活带来了极大的不便与心理负担,严重影响了人们的生活质量。随着广谱抗生素、糖皮质激素的日益广泛应用,肿瘤、器官移植、血液透析、重症监护等免疫状态低下患者的不断增多,皮肤癣菌病患(发)病率在世界范围内呈逐渐上升趋势;致病菌的生态和流行亦处于动态变化过程中。此外,流动人口增多,异地就医的增加等因素亦迫切要求对皮肤癣菌病致病菌快速准确的诊断与鉴定,以指导临床用药、防治复发和再感染等。目的:探索快速鉴定皮肤癣菌病致病菌的分子生物学方法。方法: 1、7种常见皮肤癣菌65株培养株接种于沙氏液体培养基27℃生长3-4周, CTAB法提取培养菌株的基因组DNA,采用一对半真菌通用引物(NS5、ITS1、ITS4)行半巢式PCR(先后进行两次PCR)扩增rDNA上的ITS段,用限制性内切酶BciT130I及DdeI酶切目的片段(RFLP),行8%聚丙烯酰胺凝胶电泳照相观察。 2、27例镜检阳性的临床标本(皮屑19例、甲屑5例、病发3例),一部分用于培养,余下部分(约5～20mg)采用微量DNA提取法提取致病菌DNA,半巢式PCR及RFLP方法同培养菌株。将半巢式PCR-RFLP分析鉴定结果与培养结果进行比较分析。结果: 1、7种65株常见皮肤癣菌培养株半巢式PCR扩增结果分别为:1100bp～1250bp和520bp～740bp;RFLP图谱特异,其中须癣毛癣菌和石膏样小孢子菌均具有两种特异性酶切图谱。 2、镜检阳性的临床标本中真菌培养14例皮肤癣菌和4例念珠菌(66.7%);10例标本提取出可以检测到的致病菌DNA(37.0%);半巢式PCR第一次扩增5例阳性(18.5%),大小在1100bp～1250bp,第二次扩增23例阳性(85.2%),大小在300bp～740bp。17例临床标本经限制性内切酶BciT130I及DdeI酶切后,12例与红色毛癣菌酶切图谱一致,2例与须癣毛癣菌酶切图谱一致,2例与犬小孢子菌酶切图谱一致,1例与Shin等报道的石膏样小孢子菌酶切图谱一致;另6例标本RFLP分析,ITS段均未被切开,与皮肤癣菌不同。14例培养为皮肤癣菌的标本,RFLP分析所得酶切图谱与皮肤癣菌的一致;4例培养为念珠菌的标本RFLP分析,ITS段均未被切开,与皮肤癣菌不同;RFLP分析与培养鉴定的符合率达100.0%。3例培养阴性的标本,根据酶切图谱鉴定为2例红色毛癣菌和1例犬小孢子菌。结论: 1、本研究7种65株皮肤癣菌培养菌株均具有种间特异性酶切图谱。 2、须癣毛癣菌和石膏样小孢子菌酶切带型均具有种内多态性,提示可以用于种内分型。 3、临床标本的半巢式PCR-RFLP分析与培养鉴定的符合率100.0%,分析结果可靠性好。 4、本研究从标本的采集到菌种鉴定仅在2个工作日内完成,所需标本量约5～20mg,少至8～9根病发。证实该方法对皮肤癣菌的鉴定具有快速、高效、特异的优点,较适合于临床标本皮癣菌病病原菌的鉴定。
【图文】：

株基,DNA电泳,转离

37℃温箱放置2小时。（7）取出EP管，加入等体积的氯仿-异戊醇（体积比24：1）倒置充分混合10分钟，10000转离心10分钟。（8）小心将上清移入新的 EP 管，加入 2 倍体积的无水乙醇体积的 3M 的醋酸钠，-20℃静置 20 分钟，4℃下 12000 转离心 1（9）弃上清，70%乙醇冲洗2遍，自然晾干，溶于灭菌双蒸水中保存备用。3 PCR 扩增及 RFLP分析方法均同培养菌株。结果一、7种65株培养株研究结果（一）7种菌培养株基因组DNA，，大小均在19kb左右（见图1

电泳图,皮肤癣菌,电泳图,犬小孢子菌

图6 21株须癣毛癣菌半巢式PCR第二次扩增产物电泳图1、 23泳道为 DL2000Marker， 2-22泳道为须癣毛癣菌图7 18株犬小孢子菌半巢式PCR第二次扩增产物电泳图1、 20泳道为 DL2000Marker， 2-19泳道为犬小孢子菌
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2007
【分类号】：R756

【参考文献】